發(fā)布時間：2020-06-29 06:30

【摘要】：目的:探討硫酸鈹(Beryllium sulfate,BeSO4)致人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)的炎癥反應(yīng)及其對micro RNA表達譜的影響。方法:1.以16HBE細(xì)胞為研究對象,用不同濃度BeSO4(0、100、150、200、250、300μmol/L)處理細(xì)胞48 h,采用MTT法檢測其對16HBE細(xì)胞活力的影響,分別使用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、免疫印跡試驗(Western Blot)檢測16HBE細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)、干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)的表達。2.采用small RNA測序技術(shù)檢測BeSO4處理后16HBE細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達,并按|log2Fold Change|1和P0.05的標(biāo)準(zhǔn),篩選差異表達較大的miRNAs。使用Target Scan、miRanda和Pita數(shù)據(jù)庫對部分miRNAs進行靶基因預(yù)測,利用DAVID在線工具對靶基因進行Gene Ontology(GO)分析和the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway富集分析,運用Cytoscape軟件構(gòu)建靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),使用實時熒光定量PCR(q RT-PCR)驗證候選miRNAs的表達。3.選擇目標(biāo)miRNA進行功能分析,構(gòu)建miRNA mimics、miRNA inhibitor,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)處理16HBE細(xì)胞,隨后用BeSO4處理,分別采用ELISA、Western Blot法檢測IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS的表達,探討增加或減少miRNA在BeSO4誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。使用miRanda、Target Scan、DIANA Tools和miRwalk數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)miRNA進行靶基因預(yù)測,并與m RNA測序結(jié)果(課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果)取交集,繪制韋恩圖,采用Target Scan預(yù)測miR-663b和靶基因LIF的結(jié)合位點。結(jié)果:1.與對照組相比,BeSO4抑制16HBE細(xì)胞的活力,且存在劑量反應(yīng)關(guān)系,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),BeSO4對16HBE細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為260μmol/L;BeSO4可致16HBE細(xì)胞內(nèi)IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS等炎癥相關(guān)因子表達增加(P0.05)。2.small RNA測序:與對照組相比,BeSO4處理組16HBE細(xì)胞中有179個差異表達的miRNAs,其中上調(diào)的有88個、下調(diào)的有91個。這些差異表達的miRNAs中已命名有93個、未命名有86個。3.符合差異表達篩選標(biāo)準(zhǔn)的miRNAs有28個,包括18個上調(diào)的miRNAs和10個下調(diào)的miRNAs。對28個miRNAs進行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn),23個miRNAs預(yù)測的共同靶基因轉(zhuǎn)錄本有27160(基因5140)個,其余5個miRNAs沒有預(yù)測到共同的靶基因。預(yù)測得到的靶基因主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,與轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白結(jié)合等生物學(xué)作用有關(guān)。q RT-PCR驗證結(jié)果表明miR-1306-5p、miR-193b-5p、miR-4485-3p和miR-877-5p表達上調(diào),miR-23b-5p和miR-663b表達下調(diào),與測序結(jié)果一致。4.與對照組相比,miR-663b mimics明顯下調(diào)16HBE細(xì)胞內(nèi)IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS等炎癥相關(guān)因子的表達(P0.05),減輕BeSO4對16HBE細(xì)胞的炎癥反應(yīng),而miR-663b inhibitor則增加了16HBE細(xì)胞內(nèi)IL-10、TNF-α、IFN-γ、COX-2及i NOS等炎癥相關(guān)因子的表達(P0.05)。5.預(yù)測到miR-663b的靶基因共有271個,與m RNA測序結(jié)果有交集的有65個。通過軟件分析miR-663b與LIF的3’UTR存在結(jié)合位點,LIF是miR-663b的潛在靶基因。而基因LIF主要參與JAK-STAT信號通路。結(jié)論:1.BeSO4可致16HBE細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。2.BeSO4可致16HBE細(xì)胞內(nèi)88個miRNAs表達上調(diào),91個miRNAs表達下調(diào)。3.miR-663b的潛在靶基因是LIF。miR-663b過表達可減輕BeSO4致16HBE細(xì)胞的炎癥反應(yīng);而miR-663b的下調(diào)則加重BeSO4致16HBE細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R114
【圖文】：

第 3 章 結(jié) 果第 3 章 結(jié) 果對 16HBE 細(xì)胞活力的影響估 BeSO4對 16HBE 細(xì)胞的毒性作用，用濃度為 0、10ol/L 的 BeSO4處理 16HBE 細(xì)胞 48 h，MTT 檢測 16H對照組相比，不同濃度的 BeSO4抑制 16HBE 細(xì)胞的，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且 BeSO4對 1（IC50）約為 260 μmol/L，見圖 3.1。

圖 3.2 BeSO4對 16HBE 細(xì)胞內(nèi) IL-10、TNF-α和 IFN-γ的影響A：IL-10 蛋白表達量；B：TNF-α蛋白表達量；C：IFN-γ蛋白表達量（*與對照組相比，P＜0.05）3.3 BeSO4對 16HBE 細(xì)胞內(nèi) COX-2、iNOS 蛋白表達的影響用濃度為 0、100、150、200、250、300 μmol/L 的 BeSO4處理 16HBE 細(xì)胞48 h，用 Western Blot 法檢測細(xì)胞中 COX-2、iNOS 蛋白的表達水平。與對照組相比，不同濃度的 BeSO4處理增加 16HBE 細(xì)胞種 COX-2、iNOS 蛋白的表達，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著 BeSO4濃度的增大，COX-2、iNOS蛋白的表達水平也逐漸增加，見圖 3.3。

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本文編號：2733541