發(fā)布時(shí)間：2020-05-31 12:54

【摘要】：背景錳是參與蛋白、脂質(zhì)合成的必需微量元素之一,是多種酶蛋白的輔因子。正常狀況下,人們從飲食中即可攝入足夠的錳。錳在人體過量聚集會(huì)導(dǎo)致錳中毒,而對其神經(jīng)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)一直是研究關(guān)注的熱點(diǎn)問題。過量錳暴露能誘導(dǎo)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷,引起類帕金森氏癥的臨床癥狀。小膠質(zhì)細(xì)胞活化在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中發(fā)揮重要作用,前期的研究顯示,錳神經(jīng)毒性可能與小膠質(zhì)細(xì)胞活化,進(jìn)而通過神經(jīng)炎癥反應(yīng)誘發(fā)神經(jīng)元損傷有關(guān);抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化能部分緩解錳的神經(jīng)毒性作用,而其中的具體機(jī)制尚不完全明確,因此,盡早發(fā)現(xiàn)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能的關(guān)鍵分子有可能在錳神經(jīng)毒性的研究中開辟新的領(lǐng)域。LRRK2是一種多結(jié)構(gòu)域的亮氨酸激酶,主要分布在細(xì)胞質(zhì)及線粒體外膜中。LRRK2富含亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域、DFG樣基序、RAS域、GTP酶域、MLK域和WD40等多種結(jié)構(gòu)域,在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。已證實(shí)多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制,包括帕金森氏癥和克羅恩病,都與LRRK2的突變有密切關(guān)系。新近研究發(fā)現(xiàn),LRRK2不僅在神經(jīng)元中發(fā)揮重要作用,在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的生理功能中也發(fā)揮了重要功能。LRRK2在小膠質(zhì)細(xì)胞中存在高表達(dá),且抑制LRRK2的表達(dá)能顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化功能。前期芯片結(jié)果提示,錳暴露后能顯著引起體內(nèi)LRRK2表達(dá)的改變,而其中的具體機(jī)制尚不明確。本課題試圖發(fā)現(xiàn)LRRK2在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性及小膠質(zhì)細(xì)胞活化中是否發(fā)揮重要作用,為揭示錳神經(jīng)毒性的具體機(jī)制提供新的理論依據(jù)。LRRK2是一種多結(jié)構(gòu)域的亮氨酸激酶,主要分布在細(xì)胞質(zhì)及線粒體外膜中。LRRK2富含亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域、DFG樣基序、RAS域、GTP酶域、MLK域和WD40等多種結(jié)構(gòu)域,在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。已證實(shí)多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制,包括帕金森病和克羅恩病,都與LRRK2的突變有密切關(guān)系。新近研究發(fā)現(xiàn),LRRK2不僅在神經(jīng)元中發(fā)揮重要作用,在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的生理功能中也發(fā)揮了重要功能。LRRK2在小膠質(zhì)細(xì)胞中存在高表達(dá),且抑制LRRK2的表達(dá)能顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化功能。前期芯片結(jié)果提示,錳暴露后能顯著引起體內(nèi)LRRK2表達(dá)的改變,而其中的具體機(jī)制尚不明確。本課題試圖發(fā)現(xiàn)LRRK2在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性及小膠質(zhì)細(xì)胞活化中是否發(fā)揮重要作用,為揭示錳神經(jīng)毒性的具體機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。自噬參與多種生理過程,在維持細(xì)胞正�；顒�(dòng)中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞自噬功能在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。LRRK2在調(diào)控細(xì)胞自噬功能中發(fā)揮巨大作用,小膠質(zhì)細(xì)胞自噬體膜結(jié)構(gòu)上存在LRRK2的結(jié)合位點(diǎn),提示LRRK2可能通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞自噬進(jìn)而影響小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。前期研究發(fā)現(xiàn),錳暴露通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬功能紊亂,加劇小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。那么LRRK2是否通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞自噬及相關(guān)信號通路,進(jìn)而參與對錳神經(jīng)毒性的影響,尚未見報(bào)道。因此,本研究試圖發(fā)現(xiàn)自噬及相關(guān)通路在錳誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及LRRK2改變中的具體作用,研究結(jié)果有可能為治療和防護(hù)錳神經(jīng)毒性提供新的理論依據(jù)。目的本研究擬通過建立體內(nèi)、外錳暴露模型,驗(yàn)證錳暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響;通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),檢測錳暴露后小膠質(zhì)細(xì)胞中LRRK2的表達(dá)情況;通過干預(yù)LRRK2的表達(dá),檢測LRRK2在錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的具體作用;通過檢測錳暴露后自噬蛋白及信號通路的表達(dá),探究自噬及信號通路在錳誘導(dǎo)LRRK2表達(dá)改變中的具體作用,研究結(jié)果將為防治錳神經(jīng)毒性提供新的思路和依據(jù)。方法1.建立模型1)動(dòng)物模型:C57BL/6小鼠分為對照組、錳暴露組、LPS陽性對照組。給藥方式為皮下注射,劑量為對照組0.9%NaCl,錳暴露組100 mg/kg MnCl_2,LPS組1 mg/ml LPS,給藥時(shí)間:隔天注射一次,共注射3次。2)細(xì)胞模型:BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,錳濃度為100μmol/L,LPS濃度為1μg/ml,刺激時(shí)間24 h。2.采用原子吸收分光光度計(jì)法檢測小鼠血錳、腦錳含量。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證錳暴露對運(yùn)動(dòng)能力的影響;免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測錳暴露后體內(nèi)TH蛋白的變化;免疫組織化學(xué)染色、Western blot、qPCR、ELISA檢測體內(nèi)外模型錳暴露后小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化及炎性因子的表達(dá)水平。3.運(yùn)用免疫熒光染色、Western blot和qPCR技術(shù)檢測體內(nèi)、外錳暴露模型中LRRK2的表達(dá)情況;運(yùn)用siRNA干擾技術(shù)、抑制劑、腺病毒多種檢測方法觀察抑制LRRK2后錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)變化;通過腦立體定位注射LRRK2低表達(dá)病毒,觀察錳暴露后小鼠運(yùn)動(dòng)能力及相關(guān)蛋白的改變情況。4.運(yùn)用免疫熒光染色、透射電鏡、Western blot和qPCR等技術(shù)檢測體內(nèi)、外錳暴露模型中自噬相關(guān)分子的表達(dá)變化;通過多種手段干預(yù)LRRK2的表達(dá),觀察自噬相關(guān)分子的表達(dá)情況;運(yùn)用Western blot檢測LRRK2與AMPK、mTOR信號通路之間的相互作用,利用相應(yīng)蛋白的特異性抑制劑,觀察信號通路相關(guān)蛋白的對LRRK2表達(dá)的影響。結(jié)果1.錳暴露能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化并引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)體內(nèi)原子吸收結(jié)果顯示,與對照組相比,染錳組的血錳、腦錳值顯著增高(P0.05);曠場實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示染錳組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著下降。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,錳暴露能夠引起黑質(zhì)、紋狀體區(qū)TH蛋白的表達(dá)量減少、Iba-1、CD68陽性細(xì)胞比例明顯增加(P0.05);Western blot、qPCR結(jié)果顯示,體內(nèi)、外錳暴露均能夠引起炎癥相關(guān)分子的表達(dá)增加(P0.05);ELISA結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)錳暴露能夠誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)增加(P0.05)。2.LRRK2在錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)活化及神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的作用Western blot、免疫熒光染色結(jié)果顯示錳暴露能夠顯著增加黑質(zhì)、紋狀體中LRRK2的表達(dá)量(P0.05);免疫熒光染色結(jié)果表明,錳暴露能夠引起B(yǎng)V2細(xì)胞中LRRK2陽性細(xì)胞比例增加(P0.05);Western blot、qPCR結(jié)果證明錳暴露能顯著增加BV2細(xì)胞中LRRK2的表達(dá)(P0.05);通過LRRK2抑制劑、AV-LRRK2腺病毒及siRNA-LRRK2技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制LRRK2表達(dá)能顯著抑制BV2細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)(P0.05);立體定位注射AAV-LRRK2病毒,降低體內(nèi)LRRK2的表達(dá)能顯著抑制錳暴露對小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響(P0.05);Western blot結(jié)果提示降低體內(nèi)LRRK2的表達(dá)能減少錳暴露對TH蛋白影響,并顯著抑制錳暴露導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞活化;結(jié)果提示LRRK2在錳暴露誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化中發(fā)揮了重要作用。3.自噬及信號通路在錳暴露誘導(dǎo)LRRK2改變中的作用Western blot、qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),錳暴露后能增加體內(nèi)、外自噬相關(guān)分子的表達(dá)(P0.05);透射電鏡可觀察到錳暴露后自噬泡數(shù)目顯著增多(P0.05);通過LRRK2抑制劑、AV-LRRK2腺病毒及siRNA-LRRK2技術(shù),抑制LRRK2表達(dá)能顯著抑制BV2細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)(P0.05);Western blot結(jié)果提示錳暴露能夠顯著減少小鼠黑質(zhì)、紋狀體中mTOR磷酸化水平(P0.05),同時(shí)增加AMPK的磷酸化水平;抑制LRRK2能顯著抑制錳對mTOR磷酸化的影響(P0.05);抑制LRRK2不能改變錳暴露對AMPK磷酸化水平的影響,而加入AMPK抑制劑能顯著抑制錳的毒性作用和LRRK2的改變。結(jié)論綜上所述,本課題的研究率先發(fā)現(xiàn)LRRK2是錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的重要原因;降低LRRK2的表達(dá)可能對錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)活化起到抑制作用,從而減輕錳神經(jīng)毒性作用;LRRK2是通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞自噬功能,導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的功能障礙;AMPK信號通路和mTOR信號通路可能是錳調(diào)控自噬的關(guān)鍵信號通路。
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文子激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和誘導(dǎo)型一氧OS）后，導(dǎo)致活性氧物質(zhì)和一氧化氮（NO）的形成[39, 40]�；罨挠型淌商匦约吧窠�(jīng)免疫性功能，對于 CD200 / CD200R、CD47 / C化因子配體 1 及其受體（CX3CL1 / CX3CR）的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)蛋白和補(bǔ)體系統(tǒng)的成分（C1q 和 C3）。此外還可以清除細(xì)胞碎片元[41]。轉(zhuǎn)錄因子如核因子 κB（NF-κB），STAT1、STAT3 和 SMAD行性疾病中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并造成神經(jīng)炎癥此過程中自噬發(fā)揮怎樣的作用，神經(jīng)炎癥反應(yīng)造成多巴胺能神經(jīng)元制尚不清楚。自噬促進(jìn)基因 ULK1（unc-51 如自噬激活激酶 1）是哺素靶標(biāo)復(fù)合物 1（mTORC1）的負(fù)調(diào)節(jié)器，通過與 mTOR 蛋白的相胞的生存[42]。

圖 2 小膠質(zhì)細(xì)胞的活化類型[62]導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)機(jī)制近的研究發(fā)現(xiàn)錳對小膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用受多種信號通路的調(diào)控示，錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)活化通過激活 NF- B 和 MAPK p38 信號通路[71究顯示錳誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化與 AP-1 密切相關(guān)[72]。除了 p38，另激酶，ERK 和 JNK 也在錳誘導(dǎo)神經(jīng)炎性反應(yīng)中起到重要作用[73, 7錳能增加 I B- 的抑制分子，從而激活 NF- B[75]，同時(shí)，錳能通路促進(jìn) I B- 的磷酸化。另有研究顯示錳能激活 MAPK 的上/6, MKK-1/2, 和 MKK-4[76]。錳暴露能特異性降低 MAPK 的負(fù)向調(diào)76]。之前的結(jié)果提示，NF- B/MAPK/AP-1 通路在錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)活作用。課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)自噬在調(diào)節(jié)錳神經(jīng)毒性及小膠質(zhì)細(xì)胞鍵作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)急性或慢性錳暴露均能引起黑質(zhì)區(qū)自噬相
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114

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10 張?jiān)铺m，鄭淑鵬，畢宜s�，，王春香，棱Q緱潰裳遙

本文編號：2689890