發(fā)布時間：2017-03-26 12:04

  本文關(guān)鍵詞：鈣離子誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小鼠肺成纖維細胞凋亡中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討小鼠肺成纖維細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡時Ⅰ型膠原蛋白的表達以及肺成纖維細胞凋亡情況,本研究使用鈣離子拮抗劑-粉防己堿(Tetrandrine,Tet)和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑-毒胡蘿卜素(Thapsigargin,TG)體外作用小鼠肺成纖維細胞,觀察鈣離子(Ca2+)失衡時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)指標和細胞凋亡情況,從ERS途徑探討細胞凋亡信號通路,闡明Ca2+、ERS、細胞凋亡的作用機理,為臨床上防治肺纖維化疾病提供理論依據(jù)。方法液氮凍存的小鼠肺成纖維細胞,放入37℃恒溫水浴箱內(nèi)進行融化,快速接種于剛配置好的完全培養(yǎng)基內(nèi),放置于5%CO2、37℃恒溫孵育箱內(nèi),定期通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞生長情況,經(jīng)常規(guī)的換液、傳代培養(yǎng)和同步化。根據(jù)MTT檢測結(jié)果將細胞分為4組,即對照組、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)組、鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組。對照組細胞給予完全培養(yǎng)基,其他3組給予5ng/ml TGF-β1作用24h后,鈣離子拮抗劑組和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組再分別給予5mg/l Tet和4μM TG作用細胞24h。進行掃描電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)、流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率和細胞周期比例、激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞內(nèi)Ca2+水平、Western-blot方法檢測Ⅰ型膠原、GRP78、Calpain-2、CHOP,免疫組織細胞化學(xué)方法檢測caspase-12、caspase-3蛋白表達。結(jié)果1細胞形態(tài)對照組和TGF-β1組在掃描電子顯微鏡下觀察,細胞膜、細胞核、染色質(zhì)形態(tài)完整,加入鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑的兩組細胞均出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài):細胞漿濃縮、細胞體積縮小、染色質(zhì)逐漸聚集呈月牙形等。2細胞周期各組間,G1期、S期、G2期變化均有顯著性差異(P0.05);與對照組相比較,加入TGF-β1作用后的細胞的G1期細胞比例降低(P0.05),S期細胞比例明顯增加(P0.05),G2期細胞比例下降(P0.05);與TGF-β1組相比較,加入鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑作用后的細胞,G2期和S期細胞比例均明顯減少(P0.05),G1期比例均明顯增加(P0.05);3細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組、TGF-β1組、鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組的凋亡率分別為6.73%、5.03%、9.60%、21.53%,各組間比較差異顯著(P0.05);鈣離子拮抗劑組和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組凋亡率明顯高于對照組和TGF-β1組。4 Ca2+濃度各組間比較差異顯著(P0.05);與對照組相比較,TGF-β1組細胞內(nèi)熒光度值變化不明顯(P0.05);與TGF-β1組相比較,加入鈣離子拮抗劑后,細胞內(nèi)的熒光度值明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但加入肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑后,細胞內(nèi)熒光度值明顯升高(P0.05);5 Western-blot檢測結(jié)果各組間成纖維細胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白、GRP78、CHOP和Calpain-2蛋白的表達均有顯著性差異(P0.05);TGF-β1組的Ⅰ型膠原蛋白表達明顯高于對照組(P0.05),但鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組的Ⅰ型膠原蛋白表達顯著降低對照組和TGF-β1組(P0.05)。與對照組相比,TGF-β1組的GRP78和CHOP蛋白表達差異不明顯(P0.05),而鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組GRP78和CHOP蛋白表達明顯高于對照組和TGF-β1組(P0.05)。與對照組相比,TGF-β1組和鈣離子拮抗劑組的Calpain-2蛋白表達差異不明顯(P0.05),肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組Calpain-2蛋白表達明顯升高(P0.05),而鈣離子拮抗劑組的Calpain-2蛋白表達與TGF-β1組比較差異不明顯(P0.05),肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組Calpain-2蛋白表達明顯升高(P0.05);6免疫細胞組織化學(xué)檢測結(jié)果各組間成纖維細胞內(nèi)caspase-12、caspase-3蛋白表達均有顯著性差異(P0.05);與對照組相比,TGF-β1組的caspase-12、caspase-3蛋白表達差異不明顯(P0.05),鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組caspase-12、caspase-3蛋白表達明顯升高(P0.05),與TGF-β1組比較,鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組caspase-12、caspase-3蛋白表達均明顯升高(P0.05)。結(jié)論1鈣離子拮抗劑和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑能改變成纖維細胞周期分布,促進成纖維細胞凋亡。2鈣離子拮抗劑和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑可使肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡,誘導(dǎo)ERS,通過ERS凋亡途徑促進細胞凋亡,可以阻止肺纖維化進程
【關(guān)鍵詞】：鈣離子 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 肺成纖維細胞 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R135.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 實驗研究13-41
• 1.1 材料與方法13-22
• 1.1.1 細胞系13
• 1.1.2 主要試劑、試劑盒名稱及來源13-14
• 1.1.3 常用實驗試劑和溶液的配置14-15
• 1.1.4 主要儀器設(shè)備15-16
• 1.1.5 成纖維細胞常規(guī)培養(yǎng)16
• 1.1.6 MTT比色法篩選鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑干預(yù)劑量和時間16
• 1.1.7 實驗分組16-17
• 1.1.8 掃描電鏡觀察L929細胞形態(tài)17
• 1.1.9 流式細胞儀檢測L929細胞周期17
• 1.1.10 流式細胞儀檢測細胞凋亡17-18
• 1.1.11 激光共聚焦顯微鏡檢測各組細胞鈣離子的濃度18
• 1.1.12 Western-blot方法檢測成纖維細胞內(nèi)GRP78、CHOP、calpain-2和Ⅰ型膠原蛋白表達情況18-21
• 1.1.13 免疫細胞化學(xué)檢測各組成纖維細胞內(nèi)caspase-12、caspase-3 蛋白表達21-22
• 1.1.14 統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析22
• 1.2 結(jié)果22-35
• 1.2.1 鈣離子拮抗劑和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑作用劑量和時間22-24
• 1.2.2 小鼠肺成纖維細胞培養(yǎng)形態(tài)觀察24-25
• 1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果25-27
• 1.2.4 鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑對成纖維細胞凋亡的影響27-28
• 1.2.5 激光共聚焦電子顯微鏡檢測鈣離子28-29
• 1.2.6 Western-blot方法檢測細胞內(nèi)GRP78、CHOP、calpain-2 和Ⅰ型膠原蛋白表達29-32
• 1.2.7 免疫細胞組織化學(xué)檢測細胞內(nèi)caspase-12、caspase-3 蛋白表達結(jié)果32-35
• 1.3 討論35-38
• 1.3.1 處理因素的選擇35
• 1.3.2 細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的變化35-36
• 1.3.3 細胞內(nèi)鈣離子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標變化36-37
• 1.3.4 抗纖維化作用37-38
• 1.4 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-41
• 第2章 綜述 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肺纖維化的研究進展41-50
• 2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與成纖維細胞41
• 2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生條件及分類41-42
• 2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路42-43
• 2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細胞凋亡43-45
• 2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣的作用45
• 2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與肺纖維化45-46
• 參考文獻46-50
• 結(jié)論50-51
• 致謝51-52
• 導(dǎo)師簡介52-53
• 作者簡介53-54
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集54

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1 饒寒敏;湯雪明;柴本甫;李慧;朱雅萍;;丹參對成纖維細胞成骨的掃描電鏡觀察[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2001年S1期

2 朱紅梅;成纖維細胞對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用研究[J];醫(yī)學(xué)綜述;2002年06期

3 魏玉玲,鄒慶,梁克玉;中藥增骨Ⅰ號對體外成纖維細胞的影響[J];中醫(yī)正骨;2004年01期

4 盧旭華,陳德玉,趙定麟;成纖維細胞成骨潛能的研究進展[J];骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2004年08期

5 魏海峰;井玲;魏雁虹;劉輝;齊玲;趙志濤;張秀云;李才;;氟對二維和三維培養(yǎng)的成纖維細胞胰島素樣生長因子-1表達的影響[J];中國生物制品學(xué)雜志;2010年05期

6 張誠s

本文編號：268761