【摘要】：目的:采用clockla敲除(clockla-l-)斑馬魚胚胎模型,探討鐘基因clockla在斑馬魚胚胎期BPA暴露所致神經(jīng)發(fā)育毒性中的作用及機制。方法:1.BPA胚胎期暴露半數(shù)致死濃度的確定在0、2.5、5、10 mg/L的BPA暴露下,統(tǒng)計斑馬魚胚胎72 h、96 h以及120 h的死亡率。根據(jù)寇氏改良法計算各個時間點的半數(shù)致死濃度(LC50),確定后續(xù)實驗的暴露時間和濃度。2.熒光素酶報告基因?qū)嶒灅?gòu)建包含或不包含斑馬魚clockla啟動子區(qū)ERE序列的質(zhì)粒,與ER共同轉(zhuǎn)染293T細胞,12h后同時用1μM BPA或E2處理細胞,24h后裂解細胞測定熒光值。3.測定野生型(WT)和clockla-l-斑馬魚的胚胎畸形率,行為運動及細胞凋亡的變化顯微鏡下挑選健康的WT和clocka-l-斑馬魚受精胚胎,隨機分組。在6 hpf(受精后6小時)時用0、1、5、25 μMBPA處理胚胎,96 h后,在體視顯微鏡下觀察幼魚,統(tǒng)計畸形率。清水沖洗三次后置于96孔板中,每孔一條。設(shè)置斑馬魚行為測定儀程序,連續(xù)監(jiān)測幼魚在光照或黑暗條件下的行為運動。胚胎暴露96 h后,吖啶橙染色20 min,PBS洗滌兩次,熒光顯微鏡下觀察鑒定凋亡細胞的分布變化。4.PI3K/AKT-Nrf2-ARE 通路相關(guān)基因(PI3k、AKT、Nrf2、Keapl、Nqo-1)表達變化的測定在6 hpf時用0、1、5、25μM BPA處理WT和clockla-l-斑馬魚胚胎,96 h后,將同一處理組幼魚收集到一個EP管中,DEPC水洗滌兩次,加入Trizol研磨提取RNA,RT-PCR檢測各相關(guān)基因表達情況。結(jié)果:1.BPA與雌二醇作用類似,都可以通過與clockla啟動子區(qū)的ERE序列結(jié)合,激活clockla的轉(zhuǎn)錄。2.不同濃度BPA對斑馬魚胚胎產(chǎn)生的影響不同:在中高濃度處理組中幼魚畸形率升高,運動行為下降;高濃度處理組斑馬魚幼魚體內(nèi)凋亡細胞增多。鐘基因clockla敲除的胚胎中,以上改變更加明顯。3.BPA暴露后,斑馬魚PI3k/AKT-Nrf2-ARE通路及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因表達發(fā)生改變。在野生型斑馬魚中,PI3k、AKT1、Nrf2和Nqo-1基因表達量在1μM濃度組升高,Nrf2和Keap1基因在在5μM濃度處理組表達增加。但在clockla敲除的斑馬魚中,只有Nrf2基因在25 μM處理組表達降低,其他基因表達均無明顯變化。結(jié)論:1.BPA作為一種類雌激素的環(huán)境污染物,能夠產(chǎn)生與雌二醇相似的作用,激活斑馬魚鐘基因clockla的表達。2.BPA處理對clockla敲除斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育毒性更明顯,提示該基因可起一定的保護作用。3.clockla發(fā)揮保護作用的機制之一,可能是通過激活下游的PI3k/AKT-Nrf2-ARE 通路實現(xiàn)的。
【圖文】：

ｐ＜０．０１；邋＊＊＊表示邋ｐ＜０．００１。逡逑２．２邋ＢＰＡ胚胎期暴露導(dǎo)致ｃｌｏｃｋｌａ基因表達變化逡逑如圖１．２所示，１、５、２５邋ｕＭ邋ＢＰＡ暴露后的斑馬魚胚胎ｃｌｏｃｋｌａ基因相對表逡逑達量升高，并在低中濃度組呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，在高濃度進入飽和平臺期。逡逑ｃｌｏｃｋｌａ逡逑邐邐邋？逡逑３］邐，逡逑Ｃ邐一逡逑0邐食邐？？？？？逡逑Ｉ２．二邋Ｉ邋…逡逑ｑ邋＿邋＾邐丨煖邋ｃ．：．：逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋１邋ＵＭ邋５邋ｐＭ邋２５邋ＵＭ逡逑圖ｌ．２邋ＢＰＡ對斑馬魚ｃｌｏｃｋｌａ基因表達的影響逡逑１２逡逑

通過與斑馬魚ＥＲ質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染２９３Ｔ細胞，熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)：在轉(zhuǎn)染逡逑了邋ｃｌｏｃｋｌａ－Ｌｕｃ質(zhì)粒組加入１邋的ＢＰＡ或Ｅ２后，，熒光素酶活性明顯升高；而逡逑轉(zhuǎn)染了突變質(zhì)粒ｃｌｏｃｋｌａ邋ｍｕｔ－Ｌｕｃ的組則沒有出現(xiàn)升高的現(xiàn)象（圖１．４）。并且與逡逑相同處理條件下的轉(zhuǎn)染ｄｏｃｋ丨ａ－Ｌｕｃ組相比，降低具有統(tǒng)計學(xué)差異。逡逑ＥＲａ逡逑２００－ｊ邐＾ 逡逑0５邐：Ｃ：：ｉ邋ｃｌｏｃｋｌ邋ａ－Ｌｕｃ逡逑ｃ邐■邋ｃｉｏｃｋｌａ邋ｍｕｔ－Ｌｕｃ逡逑｜邋＾邋＃逡逑§邋１００－邋■邋＊逡逑５°邐Ｔ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＢＰＡ邐Ｅ２逡逑圖ｌ．４熒光素酶相對表達量逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 鄒蘇琪;殷梧;楊昱鵬;陳林;胡兵;;斑馬魚行為學(xué)實驗在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2009年01期

本文編號：2681286