發(fā)布時(shí)間：2020-05-18 20:08

【摘要】：目的:本研究旨在探討新興污染物TBBPA及其衍生物TBBPA-BHEE、TBBPABGE、TBBPA-BAE和TBBPA-BDBPE對(duì)人胎盤(pán)BeWo細(xì)胞增殖活性的影響,并檢測(cè)TBBPA和TBBPA-BHEE對(duì)BeWo細(xì)胞ATP含量和線粒體膜電位的影響,以探索TBBPA和TBBPA-BHEE線粒體相關(guān)胎盤(pán)毒性機(jī)制;本研究重點(diǎn)關(guān)注TBBPA和TBBPA-BHEE對(duì)BeWo細(xì)胞孕烯醇酮和孕激素分泌水平的影響,并探討TBBPA和TBBPA-BHEE對(duì)BeWo細(xì)胞類(lèi)固醇激素生成關(guān)鍵酶基因和蛋白表達(dá)的影響,以探索TBBPA和TBBPA-BHEE對(duì)人胎盤(pán)細(xì)胞類(lèi)固醇激素分泌的影響機(jī)制。方法:1.采用MTS法檢測(cè)0-100μM的TBBPA、TBBPA-BHEE、TBBPA-BGE和TBBPA-BDBPE及0-50μM TBBPA-BAE染毒處理24 h和48 h對(duì)BeWo細(xì)胞增殖活性的影響。2.檢測(cè)0、0.05、1、10和100μM的TBBPA和0、0.05、1、10和25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理48 h對(duì)BeWo細(xì)胞線粒體膜電位的影響。3.檢測(cè)0、0.05、1、10和100μM的TBBPA和0、0.05、1、10和25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理48 h對(duì)BeWo細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響。4.采用ELISA技術(shù)檢測(cè)0、0.05、1、10和100μM的TBBPA和0、0.05、1、10和25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理BeWo細(xì)胞48 h后,含毒培養(yǎng)基中孕烯醇酮和孕激素的水平。5.采用qPCR方法檢測(cè)0、0.05、1、10和100μM的TBBPA和0、0.05、1、10和25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理BeWo細(xì)胞48 h后,BeWo細(xì)胞內(nèi)cyp11a1和3β-hsd基因mRNA的表達(dá)水平。6.采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)0、0.05、1、10和100μM的TBBPA和0、0.05、1、10和25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理BeWo細(xì)胞48 h后,BeWo細(xì)胞內(nèi)CYP11A1和3β-HSD的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.MTS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,TBBPA、TBBPA-BHEE、TBBPA-BGE和TBBPA-BAE分別染毒處理24 h和48 h對(duì)BeWo細(xì)胞增殖活性具有明顯的抑制作用;0-100μM TBBPA-BDBPE染毒處理24 h對(duì)BeWo細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響,0.1-100μM TBBPA-BDBPE染毒處理48 h可輕度抑制BeWo細(xì)胞的增殖活性。2.與對(duì)照組相比,100μM的TBBPA和10、25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理48 h均能誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞線粒體膜電位去極化。3.與對(duì)照組相比,100μM的TBBPA和10、25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理48 h均顯著降低BeWo細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。4.與對(duì)照組相比,100μM的TBBPA染毒處理48 h可顯著增加BeWo細(xì)胞分泌的孕烯醇酮和孕激素水平,分別增加2.54和2.07倍;0-25μM的TBBPABHEE染毒處理BeWo細(xì)胞48 h可劑量-依賴(lài)性的促進(jìn)孕烯醇酮和孕激素的分泌,0.05、1、10和25μM TBBPA-BHEE可使孕烯醇酮水平分別增加1.10、1.22、1.54和3.04倍,使孕激素水平分別增加1.06、1.22、1.58和1.61倍。5.qPCR檢測(cè)cyp11a1和3β-hsd基因mRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,100μM的TBBPA和10、25μM的TBBPA-BHEE可輕度上調(diào)cyp11a1基因mRNA的表達(dá)水平,0-100μM的TBBPA對(duì)3β-hsd基因mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯影響,10和25μM的TBBPA-BHEE顯著下調(diào)3β-hsd基因mRNA的表達(dá)水平。6.Western Blot檢測(cè)CYP11A1和3β-HSD的蛋白表達(dá)水平的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,0-100μM的TBBPA和0-25μM的TBBPA-BHEE分別染毒處理48 h對(duì)BeWo細(xì)胞CYP11A1和3β-HSD的蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響。結(jié)論:1.0-100μM的TBBPA、TBBPA-BHEE及TBBPA-BGE和0-50μM的TBBPABAE可劑量-和時(shí)間-依賴(lài)性的抑制BeWo細(xì)胞的增殖活性,五種實(shí)驗(yàn)化合物對(duì)胎盤(pán)BeWo細(xì)胞的毒性大小順序?yàn)?TBBPA-BHEETBBPA-BAETBBPA-BGETBBPATBBPA-BDBPE,毒性大小機(jī)制不完全依賴(lài)于化合物的疏水性大小。2.TBBPA和TBBPA-BHEE可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜電位去極化和降低細(xì)胞內(nèi)ATP含量介導(dǎo)BeWo細(xì)胞毒性,且TBBPA和TBBPA-BHEE可能是誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞凋亡的激動(dòng)劑。3.TBBPA和TBBPA-BHEE是潛在的內(nèi)分泌干擾物,可刺激胎盤(pán)BeWo細(xì)胞分泌孕烯醇酮,并可通過(guò)提高孕烯醇酮的分泌水平刺激孕激素分泌增加。4.TBBPA和TBBPA-BHEE促進(jìn)孕烯醇酮和孕激素分泌的機(jī)制與類(lèi)固醇激素生成關(guān)鍵酶CYP11A1和3β-HSD表達(dá)無(wú)關(guān)。但TBBPA和TBBPA-BHEE促進(jìn)孕激素分泌的機(jī)制在一定程度上與孕烯醇酮分泌增加有關(guān)。
【圖文】：

BPA 及其衍生物分別染毒 24 h 和 48 h 對(duì) BeWo 細(xì)胞增殖活PA 分別染毒 24h 和 48h 后的細(xì)胞活性；B：TBBPA-BHEE h 后的細(xì)胞活性；C：TBBPA-BGE 分別染毒 24 h 和 48 h 后A-BAE 分別染毒 24 h 和 48 h 后的細(xì)胞活性；TBBPA-BDBP 48h 后的細(xì)胞活性。注：*表示與 Control 組相比，P<0.05；暴露濃度下，，48 h 染毒組和 24 h 染毒組相比，P < 0.05）PA 及其四種衍生物分別染毒處理 BeWo 細(xì)胞 24h 和 48h 的 TBBPA TBBPA-BHEE TBBPA-BGE TBBPA-BAE TB.58×10342.69 208.40 45.40 115.30 11.58 25.84 17.96 示無(wú)細(xì)胞活性抑制作用，未獲得 IC50BPA 和 TBBPA-BHEE 對(duì) BeWo 細(xì)胞線粒體膜電位的

1.2 TBBPA 和 TBBPA-BHEE 染毒 48 h 對(duì) BeWo 細(xì)胞線粒體膜電位的影（注：CCCP 10 μM 為陽(yáng)性對(duì)照組；*表示與 Control 組相比，P < 0.05）2.3 TBBPA 和 TBBPA-BHEE 對(duì) BeWo 細(xì)胞內(nèi) ATP 含量的影響以 0、0.05、1、10、100μMTBBPA 和 0、0.05、1、10、25μMTBBPA-B別染毒處理 BeWo 細(xì)胞 48 h 后，檢測(cè)細(xì)胞中 ATP 含量的變化情況。結(jié)果 所示，與對(duì)照組相比，0.05 和 1 μM TBBPA 染毒處理 48 h 對(duì) BeWo 細(xì)P 含量無(wú)明顯影響，10 μMTBBPA 染毒處理可使 BeWo 細(xì)胞內(nèi) ATP 含量高，100 μM TBBPA 染毒處理則引起 BeWo 細(xì)胞內(nèi) ATP 含量明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對(duì)照組相比，0.05μMTBBPA-BHEE 染毒處理 ATP 含量無(wú)明顯影響，1 μM TBBPA-BHEE 有誘導(dǎo) ATP 含量下降的趨差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），10 和 25 μM TBBPA-BHEE 可顯著Wo 細(xì)胞內(nèi)的 ATP 含量（P<0.05），且染毒濃度越高，效應(yīng)越明顯；在相條件下，10 μM TBBPA 和 TBBPA-BHEE 對(duì) BeWo 細(xì)胞內(nèi) ATP 含量的影
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2670252