【摘要】：多溴聯(lián)苯醚類(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是廣泛使用的溴代阻燃類化合物,具有半揮發(fā)性、高親脂性和難降解性等特點。2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,BDE47)是人體血液和母乳樣本中檢測到的含量最為豐富的PBDEs同系物,因其在環(huán)境和人體中含量的顯著增加而備受關(guān)注。人群資料研究表明,血漿中BDE47的濃度與甲狀腺激素(Thyroid hormones,THs)水平呈負(fù)相關(guān),提示BDE47具有甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)干擾效應(yīng)。也有研究表明,新生兒臍帶血中BDE47的濃度與其出生體重呈負(fù)相關(guān),提示發(fā)育早期暴露BDE47可能對胚胎發(fā)育造成損害。然而,BDE47干擾甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)與發(fā)育毒性的關(guān)系尚不明確。此外,目前關(guān)于PBDEs干擾甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)機(jī)制的研究多集中在對下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT軸)或者甲狀腺激素受體(Thyroxine receptors,TRs)的研究,而對調(diào)控周圍組織甲狀腺激素的脫碘酶(Deiodinase,DIO)的研究相對較少。生物轉(zhuǎn)化是外源化學(xué)物在體內(nèi)發(fā)揮毒性的重要過程,主要由細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450,CYP450)介導(dǎo)。課題組前期研究證實,BDE47能被CYP3A代謝生成一系列代謝產(chǎn)物,產(chǎn)生更強(qiáng)的生殖和發(fā)育毒性。但CYP3A介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化在BDE47干擾甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)中的作用及其與發(fā)育毒效應(yīng)的關(guān)系有待闡明。本研究運用野生型(WT)及cyp3a65敲除(KO)的斑馬魚模型,通過BDE47(1μM)經(jīng)水體暴露染毒,旨在探究CYP3A65(與人CYP3A4同源)在BDE47致斑馬魚胚胎早期發(fā)育毒性中的作用及甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的干擾機(jī)制。第一部分:CYP3A65對BDE47干擾斑馬魚甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的影響及其與發(fā)育異常的關(guān)系目的:明確CYP3A65介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化在BDE47干擾斑馬魚甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)中的作用及其與發(fā)育毒效應(yīng)的關(guān)系。方法:通過Real-time PCR及WesternBlot方法,對TALEN技術(shù)構(gòu)建的cyp3a65敲除的斑馬魚模型進(jìn)行驗證;基于野生型(WT)和cyp3a65敲除模型(KO)建立BDE47(1μM)經(jīng)水體染毒模型,觀察0-144 hpf斑馬魚胚胎的主要毒性終點指標(biāo),包括孵化率、畸形率、體長、眼及魚鰾發(fā)育;通過對比BDE47處理下WT和KO組胚胎發(fā)育的表型差異,探究cyp3a65在BDE47所致斑馬魚胚胎發(fā)育異常中的作用;運用ELISA試劑盒檢測144 hpf斑馬魚胚胎甲狀腺激素水平,包括T3、T4、rT3、TSH,并通過Real-time PCR檢測調(diào)節(jié)機(jī)體甲狀腺激素代謝的脫碘酶(dio)表達(dá)量的變化,以初步探討B(tài)DE47致斑馬魚甲狀腺激素紊亂的機(jī)制。結(jié)果:與溶劑對照組相比,BDE47染毒野生型斑馬魚(BDE47/WT)胚胎在24-58hpf孵化延遲;在96 hpf,胚胎眼部發(fā)育減小,為7.0×10~4μm~2(對照組為8×10~4μm~2);在120 hpf,對照組的魚鰾膨脹率達(dá)100%,而BDE47染毒導(dǎo)致魚鰾膨脹率僅為86%;在144 hpf,BDE47染毒組胚胎體長明顯減小,為3.6×10~3μm(對照組為3.8×10~3μm),且畸形率高達(dá)70%,以脊柱背向彎曲為主,而對照組幾乎無畸形。敲除cyp3a65后,暴露于BDE47的斑馬魚(BDE47/KO)胚胎的孵化率始終高于BDE47/WT組,96 hpf的眼部大小(7.7×10~4μm~2)、120 hpf的魚鰾膨脹率(94%)及144 hpf的體長(3.7×10~3μm)和畸形率(58%)均明顯改善。此外,與對照組相比,BDE47/WT組斑馬魚Ⅰ型脫碘酶(dio1)和Ⅱ型脫碘酶(dio2)的表達(dá)無明顯變化,而Ⅲ型脫碘酶(dio3a、dio3b)的表達(dá)明顯升高,同時伴隨甲狀腺激素T3水平的顯著降低,rT3顯著升高,但T4和TSH無明顯改變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),T3/T4的比值顯著降低。敲除cyp3a65后,斑馬魚三種類型脫碘酶的表達(dá)均與對照組無異,甲狀腺激素T3、rT3水平及T3/T4比值也顯著改善。第二部分:CYP3A65對BDE47的代謝活化作用及其影響斑馬魚甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的機(jī)制目的:分析BDE47在斑馬魚體內(nèi)的代謝,探討CYP3A65對BDE47的生物轉(zhuǎn)化作用及其影響甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。方法:利用已建立的BDE47染毒的野生型(WT)和cyp3a65敲除的(KO)斑馬魚胚胎模型,運用UPLC-MS/MS和GC-MS/MS檢測144 hpf體內(nèi)BDE47活性代謝產(chǎn)物的含量,分析CYP3A65在代謝BDE47生成活性產(chǎn)物中的作用;用所測得的代謝產(chǎn)物染毒野生型斑馬魚胚胎至144 hpf,分析代謝產(chǎn)物的儲留程度及相互轉(zhuǎn)化關(guān)系;用所測得的代謝產(chǎn)物分別染毒W(wǎng)T和KO斑馬魚胚胎至144hpf,通過Real-time PCR檢測其對Ⅲ型脫碘酶(dio3a、dio3b)表達(dá)的影響,分析BDE47經(jīng)CYP3A65代謝后干擾dio3表達(dá)的主要代謝產(chǎn)物。結(jié)果:BDE47可在斑馬魚胚胎體內(nèi)被代謝生成3-OH-BDE47、5-OH-BDE47、6-OH-BDE47、3-MeO-BDE47、5-MeO-BDE47、6-MeO-BDE47六種產(chǎn)物,且羥基化代謝產(chǎn)物(OH-BDE47)的含量整體高于甲氧基代謝產(chǎn)物(MeO-BDE47)的含量;BDE47/WT組斑馬魚體內(nèi)OH-BDE47及MeO-BDE47的含量均高于BDE47/KO組,提示CYP3A65可能是斑馬魚體內(nèi)BDE47的代謝酶;六種代謝產(chǎn)物在斑馬魚體內(nèi)均有一定的儲留,且除了5-OH-BDE47只能向5-MeO-BDE47單向轉(zhuǎn)化外,3-OH-BDE47與3-MeO-BDE47之間、6-OH-BDE47與6-MeO-BDE47可存在相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),僅3-MeO-BDE47能顯著上調(diào)WT及KO組斑馬魚dio3a、dio3b的表達(dá),其余幾種代謝產(chǎn)物對dio3表達(dá)無明顯影響,推測3-MeO-BDE47是BDE47經(jīng)CYP3A65代謝干擾斑馬魚dio3表達(dá)的關(guān)鍵活性產(chǎn)物。綜合上述結(jié)果,我們推測3-MeO-BDE47可能是BDE47經(jīng)CYP3A65代謝后上調(diào)dio3的主要活性產(chǎn)物。結(jié)論本研究基于野生型(WT)和cyp3a65敲除(KO)斑馬魚染毒模型,初步闡明了CYP3A65在BDE47干擾斑馬魚甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)中的作用及其與發(fā)育異常的關(guān)系,從生物轉(zhuǎn)化的角度探討了BDE47經(jīng)CYP3A65代謝后的主要活性產(chǎn)物及其對斑馬魚甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的干擾機(jī)制,獲得了如下結(jié)論:1.BDE47可導(dǎo)致斑馬魚早期發(fā)育異常,敲除cyp3a65能明顯改善BDE47對斑馬魚胚胎發(fā)育的損傷作用;此外,BDE47可引起斑馬魚甲狀腺激素紊亂,敲除cyp3a65能明顯改善BDE47對甲狀腺激素水平的影響,提示BDE47對甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的干擾作用可能參與了斑馬魚早期發(fā)育過程,且CYP3A65在其中發(fā)揮了重要作用。2.斑馬魚CYP3A65是BDE47的主要代謝酶,所生成的六種代謝產(chǎn)物在斑馬魚體內(nèi)均有一定的儲留,且除了5-OH-BDE47只能向5-MeO-BDE47單向轉(zhuǎn)化外,其余OH-BDE47與MeO-BDE47可存在對應(yīng)的相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系。3.3-MeO-BDE47是上調(diào)斑馬魚dio3表達(dá)的關(guān)鍵活性產(chǎn)物,提示3-MeO-BDE47可能是CYP3A65代謝BDE47導(dǎo)致斑馬魚甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)異常的主要活性代謝產(chǎn)物。
【圖文】：

12T3,而DIO3主要脫內(nèi)環(huán)碘催化T4形成非活性rT3；T3內(nèi)環(huán)脫碘和rT3外環(huán)脫碘均可形成T2,進(jìn)而排出體外（圖1）[22]。圖1 脫碘酶對甲狀腺激素的調(diào)節(jié)PBDEs對脫碘酶活性和表達(dá)的影響是其導(dǎo)致THs紊亂的重要機(jī)制之一[23]。有報道稱，dio1、dio2和dio3被作為研究大鼠和其他生物（包括魚類）甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的生物標(biāo)志物[24]。許多研究表明，環(huán)境劑量下的PBDEs可對dio1、dio2和dio3的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生顯著影響[13, 23]。例如，斑馬魚胚胎暴露于0.625 ppm 的BDE-47到28 hpf 后，dio1和dio2的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[25]。BDE-99和BDE-209暴露均可導(dǎo)致人肝細(xì)胞中dio1的mRNA上調(diào)[26]。此外，體外代謝研究也表明OH-BDEs對人體肝組織中的DIO1酶活性有顯著抑制作用[27]。由此可見，PBDEs可能通過影響脫碘酶的表達(dá)從而產(chǎn)生甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)的干擾作用。生物轉(zhuǎn)化是指外源化學(xué)物在機(jī)體內(nèi)經(jīng)多種酶催化的代謝轉(zhuǎn)化，，是機(jī)體對外源化學(xué)物處置的重要過程。這一過程或者代謝解毒

analysis of variance）法對組間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)差異分析。當(dāng) P ＜ 0.05 時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，用 Graphpad Prism 6 軟件作圖。結(jié)果一、cyp3a65 基因在 WT 和 KO 斑馬魚中的表達(dá)為了鑒定 cyp3a65 敲除斑馬魚胚胎模型，本研究運用 Real-time PCR 檢測cyp3a65 在斑馬魚 144 hpf 的轉(zhuǎn)錄水平，并采用 Western Blot 進(jìn)一步驗證其表達(dá)水平。實驗結(jié)果如圖 2 所示，cyp3a65 在對照組斑馬魚（DMSO/WT）體內(nèi)有一定的表達(dá)，BDE47 染毒可誘導(dǎo)野生型斑馬魚 cyp3a65 的表達(dá)；在 cyp3a65 敲除斑馬魚（DMSO/KO）體內(nèi)幾乎沒有表達(dá)，BDE47 對 cyp3a65 敲除后的斑馬魚也失去了誘導(dǎo)作用。由此可見，本實驗室前期構(gòu)建的 cyp3a65 敲除斑馬魚模型較為成功，可用于后續(xù)實驗。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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