【摘要】：食品安全被視為一個全球性的公共衛(wèi)生問題,食源性致病菌是食品安全的一個重要方面。本文以沙門氏菌、阪崎腸桿菌、副溶血弧菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌五種食源性致病菌為供試菌株展開研究。建立了五個單重qPCR體系和一個三重qPCR體系,并圍繞湖州市微生物制劑與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室自主研發(fā)的微生物分子檢測儀,建立一種配套該儀器使用的單重?zé)晒舛縋CR自動化檢測體系。并利用樣本模擬實驗、真實食品檢測實驗和傳統(tǒng)方法驗證等實驗,確定上述各檢測方法的可靠性。主要研究結(jié)果如下:1.本文參考的五種食源性致病菌引物和探針序列來自于SN/T 1870—2007,在優(yōu)化了單重體系中探針濃度之后,建立了沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和阪崎氏腸桿菌五種食源性致病菌的單重qPCR檢測體系。經(jīng)過人工模擬樣本實驗,未經(jīng)增菌的人工模擬牛奶最低檢測限為69copies/m L,人工模擬面包的最低檢測限為37 copies/m L,同時這五種單重qPCR體系的變異系數(shù)為1.30%~3.89%。2.本研究隨后建立了能同時檢測沙門氏菌、單增李斯特菌和副溶血性弧菌的三重qPCR檢測體系。經(jīng)過面包樣本模擬實驗,利用該數(shù)據(jù)分析了沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌在該三重PCR檢測體系的最低檢測限分別達(dá)到了7 copies/m L,32 copies/m L和42 copies/m L;同時該三重檢測體系的變異系數(shù)為0.52%~2.18%,表明檢測系統(tǒng)的重復(fù)性良好。3.本研究利用單重qPCR檢測方法檢測14份食品樣品;又利用三重qPCR檢測方法檢測了40份海鮮樣品。結(jié)果表明,兩種體系可以較準(zhǔn)確的檢出食品中的食源性致病菌。單重檢測時,定量檢測僅Db2檢出沙門氏菌,而定性檢測中,Db2、Da3和Xa2樣品疑似檢出沙門氏菌。三重檢測的檢出率為71.67%,國標(biāo)方法的檢出率為82.5%,三重qPCR檢測方法中沙門氏菌的正確率為100%,副溶血弧菌檢出的正確率為50%,單增李斯特菌檢出的正確率為32%。本研究建立了三重qPCR檢測方法和與微生物分子檢測儀配套的檢測技術(shù)體系,為食品中食源性致病菌的快速檢測提供了參考。
【圖文】：

3.1 探針濃度優(yōu)化在TAKARA公司試劑推薦的體系下，為了進(jìn)一步確認(rèn)最低探針濃度，故對其做優(yōu)化實驗。探針濃度安排在10 uM、5 uM、2.5 uM、1.25 uM，結(jié)果如圖2-1。根據(jù)擴(kuò)增曲線峰形可知，，當(dāng)濃度為2.5 uM和1.25 uM時，擴(kuò)增曲線呈S型曲線，而濃度在5 uM以上時，擴(kuò)增曲線并不是嚴(yán)格意義上的S型曲線。故根據(jù)實驗結(jié)果，探針的濃度為1.25 uM。圖 2-1 探針濃度優(yōu)化結(jié)果Fig 2-1 The optimizated results of probe concentration3.2 五種食源性致病菌的 qPCR 實驗將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌和副溶血弧菌的基因組DNA分別進(jìn)行 10倍梯度稀釋后，作為qPCR模板DNA，進(jìn)行qPCR實驗。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后對應(yīng)的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)

基因組DNA分別進(jìn)行 10倍梯度稀釋后，作為qPCR模板DNA，進(jìn)行qPCR實驗。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后對應(yīng)的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值作為縱坐標(biāo)建立沙門氏菌qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2-2~2-6。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2659119