發(fā)布時(shí)間：2020-05-11 13:07

【摘要】：丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一種公認(rèn)的毒性物質(zhì),具有神經(jīng)毒性、致癌性、基因毒性、生殖毒性和遺傳毒性等。普通人群主要通過飲食攝入,職業(yè)人群可通過職業(yè)環(huán)境接觸。ACR對(duì)人類和動(dòng)物最主要的毒性作用是神經(jīng)毒性作用,而對(duì)周圍神經(jīng)的毒性作用尤為明顯。無論是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還是在長(zhǎng)期接觸該物質(zhì)的人群,都能導(dǎo)致其發(fā)生感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙,如骨骼肌無力、體重減輕、共濟(jì)失調(diào)等癥狀。ACR主要作用于神經(jīng)末梢,通過損害突觸的傳遞而發(fā)揮神經(jīng)毒性的作用。因此關(guān)注ACR對(duì)周圍神經(jīng)的損傷具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。據(jù)研究顯示,在ACR染毒后大鼠所出現(xiàn)的癥狀中,雙后肢骨骼肌無力的表現(xiàn)尤為明顯。坐骨神經(jīng)作為下肢重要的的神經(jīng),對(duì)毒性作用最為敏感,同時(shí)腓腸肌受坐骨神經(jīng)分支的支配,在后肢的運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用,而腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板(Motor endplate,MEP)是維持骨骼肌正常運(yùn)動(dòng)功能中至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)。坐骨神經(jīng)又是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突所組成,其功能狀態(tài)必然與神經(jīng)元的功能狀態(tài)密切相關(guān)。因此,本課題選取腓腸肌MEP、坐骨神經(jīng)及其對(duì)應(yīng)節(jié)段的脊髓(腰骶膨大段)進(jìn)行研究,分別檢測(cè)其組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白表達(dá)的改變,探討ACR染毒所致大鼠骨骼肌無力可能的原因,為臨床上ACR中毒后的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.建立動(dòng)物模型:SPF級(jí)成年雄性SD大鼠32只,隨機(jī)分為對(duì)照組(0mg/kg)、低(9mg/kg)、中(18mg/kg)和高(36mg/kg)劑量組,每組8只,分組灌胃染毒ACR,共21天。期間隔天稱量體重,調(diào)整給藥量,并每周進(jìn)行一次行為學(xué)檢測(cè)(步態(tài)評(píng)分和著陸足張開距離測(cè)量),第22天取材,并對(duì)腓腸肌進(jìn)行濕重的稱量。2.檢測(cè)ACR對(duì)大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的毒性影響:利用HE染色觀察大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)的變化;Nissl染色檢測(cè)大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元尼氏體含量的變化;透射電鏡觀察大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突觸的超微結(jié)構(gòu)的改變;IHC和WB檢測(cè)大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元AchE、CGRP和GAP43的表達(dá)情況。3.檢測(cè)ACR對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)的毒性影響:利用HE染色觀察大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)的改變;透射電鏡觀察大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘板層超微結(jié)構(gòu)的改變;LFB染色觀察大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘脂類含量的表達(dá)情況;IHC和WB檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)MBP和MAG的表達(dá)情況。4.檢測(cè)ACR對(duì)大鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板的毒性影響:通過HE染色觀察大鼠肌纖維結(jié)構(gòu)的改變;氯化金染色觀察大鼠神經(jīng)末梢及MEP形態(tài)數(shù)目的改變;乙酰膽堿酯酶染色檢測(cè)腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板乙酰膽堿酯酶含量的改變;IHC和WB檢測(cè)大鼠腓腸肌AchE和CGRP的表達(dá)情況。結(jié)果:1.大鼠行為學(xué)的改變:ACR染毒后大鼠體重從第三周開始,增長(zhǎng)速率與染毒劑量呈負(fù)相關(guān),高劑量組大鼠體重開始下降,組間比較差異顯著;步態(tài)評(píng)分結(jié)果顯示,對(duì)照組始終為1分,而低、中、高劑量組的得分均有所增加,且呈劑量依賴性,從第二周開始組間比較差異明顯;著陸足張開距離結(jié)果顯示,從第二周開始,高劑量組與其它組比較均顯著增寬(P0.01);從第三周開始,中劑量與對(duì)照組、低劑量組比較差異明顯(P0.01),低劑量組與對(duì)照組比較也有所增寬(P0.01)。2.脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的毒性改變:HE結(jié)果顯示,ACR染毒后,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體分布稀疏,并出現(xiàn)萎縮、染色加深;染毒后中高劑量組尼氏染色范圍變小(P0.01),染色變淺,細(xì)胞內(nèi)尼氏小體零星分布,細(xì)胞體積變小;透射電鏡結(jié)果顯示,高劑量組脊髓前角的突觸數(shù)目較少,結(jié)構(gòu)不清晰,著色淺,突觸小泡和突觸間隙的遞質(zhì)均較少;IHC和WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,低、中、高劑量組AchE、CGRP和GAP43的表達(dá)均有所減少,呈劑量依賴性,差異顯著(P0.01)。3.坐骨神經(jīng)的毒性改變:HE結(jié)果顯示,ACR染毒后,低、中劑量組髓鞘呈現(xiàn)不同程度的腫脹,軸突結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;高劑量組神經(jīng)纖維排列紊亂,髓鞘結(jié)構(gòu)不清晰,軸突消失;透射電鏡顯示染毒后髓鞘板層有空洞形成,軸索變性,施旺細(xì)胞的細(xì)胞器溶解,有髓神經(jīng)纖維之間有膠原纖維增生等現(xiàn)象;LFB髓鞘染色(伊紅法)發(fā)現(xiàn),染毒后髓鞘結(jié)構(gòu)變薄變細(xì),染色變淺且著色不均;IHC和WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,各組MBP和MAG的表達(dá)均隨染毒劑量增大而減少(P0.01)。4.腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板的毒性改變:腓腸肌濕重結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,中劑量組大鼠腓腸肌濕重明顯降低(P0.05),高劑量組降低更為顯著(P0.01);HE結(jié)果顯示染毒后肌纖維結(jié)構(gòu)變細(xì),排列密集,且有細(xì)胞核聚集的現(xiàn)象,劑量越高越明顯;氯化金染色顯示染毒后末梢神經(jīng)分支變少、變細(xì),神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)變短、變稀疏,MEP結(jié)構(gòu)較少,染色變淺,結(jié)構(gòu)不清晰;乙酰膽堿酯酶染色(亞鐵氰化銅法)顯示染毒后大鼠MEP形態(tài)變小,分布稀疏,且呈劑量依賴性,相比對(duì)照組,低、中、高劑量組乙酰膽堿酯酶含量均顯著降低(P0.01);IHC和WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,低、中、高劑量組隨染毒劑量增大,AchE和CGRP的表達(dá)逐漸減少(P0.01)。結(jié)論:1.ACR損傷了脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能,可能與ACR使AChE、CGRP和GAP43的含量下降,從而使脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)及再生的功能受損、軸突退變、突觸結(jié)構(gòu)受損致信號(hào)傳遞障礙有關(guān)。2.ACR染毒損傷了大鼠坐骨神經(jīng)的正常結(jié)構(gòu)和功能,這可能是與ACR染毒導(dǎo)致了軸索變性、MBP和MAG蛋白的表達(dá)量下降所致神經(jīng)脫髓鞘相關(guān)。3.ACR染毒所致大鼠腓腸肌濕重下降、MEP結(jié)構(gòu)改變,可能是ACR導(dǎo)致了軸索變性引起軸漿運(yùn)輸功能障礙,進(jìn)而使神經(jīng)肌肉接頭處AChE和CGRP等功能蛋白的含量下降有關(guān)。4.ACR可能通過損傷脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的胞體及軸突,使其合成、運(yùn)輸?shù)鞍啄芰ο陆?同時(shí)使坐骨神經(jīng)脫髓鞘,神經(jīng)末梢信號(hào)傳遞減弱,最終導(dǎo)致MEP退變,肌肉萎縮致骨骼肌無力的發(fā)生。
【圖文】：

鼠全段的椎骨及脊髓，箭頭所指為截取的腰骶brae and spinal cord of rats, arrow shows the tru制取 1080mg 的 ACR 晶體溶于 150ml 的mg/ml 的 ACR 原液。由于 SD 大鼠最用大鼠為 300-350g，故按大鼠體重（把原液進(jìn)行不同程度稀釋：高濃度=原液ddH2O 40ml（3.6mg/ml），低濃度=原鼠的灌胃體積（ml）=5*體重（kg），最mg/kg、18mg/kg、36mg/kg，對(duì)照組則灌50ml 的 0.9%生理鹽水中加入 2g 水合氯1500ml 的 PBS 溶液中加入 60g 多聚甲加入少許 NaOH 攪拌至溶液澄清，再加避光保存。

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文結(jié)果2.4.1 ACR 染毒對(duì)大鼠體重變化的影響結(jié)果顯示大鼠的初始體重均在 300-350g，在染毒第一周，，各組大鼠體重增長(zhǎng)幅度相同；染毒第二周，與對(duì)照組和低劑量組相比，中、高劑量組大鼠體重增長(zhǎng)的速所下降，但尚無顯著性差異（P>0.05）；染毒第三周開始，各組大鼠體重增長(zhǎng)速染毒劑量呈負(fù)相關(guān)，且高劑量組大鼠體重開始下降，與各組進(jìn)行比較，差異明顯 2-2）。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2658500