【摘要】：三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)是一種含氯有機(jī)磷酸酯類阻燃劑。它已廣泛用于塑料、紡織品、電子設(shè)備、建筑和家裝材料等產(chǎn)品。因TCEP與高分子材料是非共價(jià)鍵結(jié)合,故易從材料中釋放進(jìn)入環(huán)境。目前,在空氣、降水、地表水、地下水、飲用水以及土壤樣品中均已檢出TCEP。但尚缺乏環(huán)境介質(zhì)中TCEP濃度的季節(jié)性變化特征的系統(tǒng)性報(bào)道。不過已有實(shí)驗(yàn)研究表明,一定劑量TCEP(≥175mg/kg bw/d)處理Scl:dd Y雄性小鼠后,可檢出其肝腫瘤的形成;一定濃度TCEP(≥3.12mg/L)可引起人胚肝細(xì)胞L02和人肝腫瘤細(xì)胞Hep G2生長抑制、周期阻滯和衰老。多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)源于環(huán)境中有機(jī)物的不完全燃燒及熱分解過程,并廣泛分布于環(huán)境中,且性質(zhì)穩(wěn)定。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,Ba P)是多環(huán)芳烴中致癌性最強(qiáng)的一種化合物,它可在體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素P450酶代謝,誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。Ba P是常見的高活性間接致癌物和突變原,已被國際癌癥研究中心列為確認(rèn)致癌物。人體經(jīng)吸入空氣、飲水和攝食等多途徑復(fù)合暴露環(huán)境中TCEP和Ba P后其機(jī)體健康可受損害。不過,TCEP和Ba P的聯(lián)合毒性及其毒作用機(jī)制仍有待闡明。細(xì)胞炎性反應(yīng)是環(huán)境污染物致機(jī)體健康損害的主要分子事件之一。研究表明,進(jìn)入體內(nèi)的Ba P經(jīng)細(xì)胞色素P450酶系代謝活化后可激活白介素(Interleukin,IL)1、IL-6和IL-8等細(xì)胞炎性因子的分泌,影響肝腫瘤的發(fā)生與發(fā)展;用TCEP(175mg/kg bw/day和350mg/kg bw/day)飼養(yǎng)雄性B6C3F1小鼠兩年后可致其肝細(xì)胞嗜酸性小體發(fā)生率增加。但是,有關(guān)TCEP和Ba P聯(lián)合染毒所致細(xì)胞炎性反應(yīng)的相關(guān)研究報(bào)道尚十分有限。本研究擬在課題組前期有關(guān)TCEP單獨(dú)染毒處理人胚肝細(xì)胞L02和人肝腫瘤細(xì)胞Hep G2的毒性研究基礎(chǔ)上,探究武漢市兩個(gè)主要自來水廠四季水樣(源水、出廠水和末梢水)有機(jī)提取物中TCEP濃度的季節(jié)性變化特點(diǎn)和細(xì)胞毒性,以及TCEP和Ba P聯(lián)合染毒對細(xì)胞的毒性效應(yīng)及其可能的調(diào)控機(jī)制。本研究分為以下兩個(gè)部分:第一部分飲水有機(jī)提取物中TCEP濃度和細(xì)胞毒性目的:研究武漢市飲水有機(jī)提取物中TCEP濃度的季節(jié)性變化特點(diǎn)以及飲水有機(jī)提取物對肝細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的影響。方法:在四個(gè)季節(jié),采集武漢市兩個(gè)主要水廠(A水廠的源水為長江,B水廠的源水為漢江)的源水、出廠水和末梢水(共40個(gè)水樣)。用固相萃取方法富集水中痕量有機(jī)污染物。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測有機(jī)提取物中TCEP的濃度。設(shè)一定濃度(12.5m L/m L、25.0m L/m L、50.0m L/m L和100.0m L/m L)的水有機(jī)提取物和二甲基亞砜(溶劑對照,終濃度(V/V):0.1%)處理L02細(xì)胞24h和48h,用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:在取自武漢市不同源水的自來水廠的四季水樣(包括源水、出廠水和末梢水)中TCEP檢出率達(dá)90%;A水廠的四季源水、出廠水和末梢水中TCEP檢出濃度范圍分別為:檢出限(method detection limit,MDL)或MDL~676ng/L、33~78ng/L和35~257ng/L;B水廠的四季源水、出廠水和末梢水中TCEP檢出濃度范圍分別為:MDL或MDL~505ng/L、MDL或MDL~104ng/L和MDL或MDL~130ng/L。冬季兩水廠源水中TCEP濃度(A水廠:676ng/L;B水廠:505ng/L)均高于其他季節(jié),秋季A水廠和春季B水廠的末梢水中TCEP檢出濃度最高,分別是257ng/L和130ng/L。兩水廠夏季源水有機(jī)提取物細(xì)胞毒性均高于其他季節(jié);兩水廠夏、秋季出廠水和末梢水的細(xì)胞毒性均高于春冬季。兩水廠的四季源水有機(jī)提取物最高濃度組(100.0m L/m L)均觀察到細(xì)胞凋亡率增高(P0.05)。結(jié)論:兩個(gè)自來水廠凈水處理工藝尚無法有效去除水中TCEP;兩水廠的四季源水中TCEP濃度均呈現(xiàn)“冬春季高,夏秋季低”的特點(diǎn),兩水廠的四季源水有機(jī)提取物最高濃度組(100.0m L/m L)均可觀察到細(xì)胞發(fā)生凋亡。第二部分EGFR-ERK通路調(diào)控TCEP聯(lián)合Ba P致細(xì)胞炎性反應(yīng)的機(jī)制目的:研究TCEP和Ba P聯(lián)合染毒致肝細(xì)胞炎性反應(yīng)及EGFR-MAPK信號(hào)通路的相關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法:用一定濃度的TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L或200.00mg/L)和50μM Ba P單染和聯(lián)合染毒Hep G2細(xì)胞24h和48h,同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑對照組(終濃度(V/V):0.1%)。為評價(jià)TCEP致細(xì)胞毒性,MTT實(shí)驗(yàn)用于檢測細(xì)胞存活率;選用相應(yīng)試劑盒評價(jià)丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、氧基抗氧化能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)和羥基抗氧化能力(hydroxygen radical absorbance capacity,HORAC)等細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8的蛋白水平。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測IL-6和IL-8的m RNA表達(dá)水平。用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(western blotting)檢測表皮生長因子受體(extracellular signal regulated protein kinase,EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)信號(hào)通路相關(guān)蛋白質(zhì)(EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK、STAT3、p-STAT3、p65和p-p65)的表達(dá)。用EGFR抑制劑(AG1478)、ERK抑制劑(U0126)或p38抑制劑(SB203580)預(yù)處理Hep G2細(xì)胞1h后,再用50mg/L TCEP和50μM Ba P單獨(dú)及聯(lián)合處理Hep G2細(xì)胞24h,檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8釋放水平、IL-6和IL-8的m RNA表達(dá)水平。結(jié)果:在24和48h觀察時(shí)點(diǎn),與溶劑對照組相比,200mg/L TCEP單獨(dú)染毒、≥3.12mg/L TCEP和50μM Ba P聯(lián)合組顯現(xiàn)細(xì)胞存活率降低(P0.05),IL-6和IL-8的m RNA水平上調(diào)(P0.05),細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8蛋白釋放增加(P0.05),一定濃度的TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L和50mg/L)分別與50μM Ba P聯(lián)合染毒Hep G2細(xì)胞24h和48h,可上調(diào)p-EGFR蛋白的表達(dá)(P0.05),≥3.12mg/L TCEP與50μM Ba P的聯(lián)合染毒上調(diào)了p-ERK和p-p38蛋白的表達(dá)(P0.05)。與對應(yīng)濃度的TCEP單獨(dú)處理組比較,≥3.12mg/L TCEP和50μM Ba P聯(lián)合染毒致細(xì)胞存活率降低(P0.05),且IL-6和IL-8的m RNA水平上調(diào)及細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8蛋白的釋放增加(P0.05);一定濃度TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L和50mg/L)和50μM Ba P聯(lián)合染毒上調(diào)了p-EGFR蛋白的表達(dá)(P0.05),≥3.12mg/L TCEP與50μM Ba P聯(lián)合染毒上調(diào)了p-ERK和p-p38蛋白的表達(dá)(P0.05)。與僅用TCEP(50mg/L)和Ba P(50μM)聯(lián)合染毒Hep G2細(xì)胞組相比,添加抑制劑(AG1478、U0126或SB203580)與TCEP(50mg/L)及Ba P(50μM)共培養(yǎng)細(xì)胞組的IL-6和IL-8在m RNA水平和細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8蛋白釋放水平均降低(P0.05);但是,AG1478與TCEP(50mg/L)及Ba P(50μM)共培養(yǎng)僅觀察到p-ERK蛋白表達(dá)呈顯著性降低(P0.05)。結(jié)論:TCEP和Ba P聯(lián)合染毒對細(xì)胞存活的影響可能大于TCEP或Ba P的單獨(dú)作用;EGFR-ERK信號(hào)通路可能參與了一定濃度TCEP與50μM Ba P聯(lián)合染毒激活肝細(xì)胞釋放炎性分子的調(diào)控。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文1mL 移液管準(zhǔn)確量取 TCEP 標(biāo)準(zhǔn)中間液 B（103mg/L）至 100mL 棕色容量瓶，用乙腈定容，即配制成濃度為 10mg/L 的 TCEP 標(biāo)準(zhǔn)中間液 C。（4）TCEP 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制：如圖 1 所示，由 TCEP 標(biāo)準(zhǔn)中間液 C（10mg/L）用乙腈逐級稀釋成不同濃度的 TCEP 標(biāo)準(zhǔn)液。共設(shè)定了 6 個(gè)濃度梯度，分別是10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L 和 5000μg/L。所有標(biāo)樣均注明濃度和配置日期，，貯存在 4 C 冰箱中備用，TCEP 標(biāo)準(zhǔn)貯備液有效期為 6 個(gè)月，TCEP 標(biāo)準(zhǔn)中間液和 TCEP 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液有效期為 1 個(gè)月。

圖 2 水樣采集布點(diǎn)示意圖1.3 固相萃取水體中有機(jī)污染物濃度通常很低，因此檢測分析時(shí)應(yīng)選擇恰當(dāng)?shù)挠袡C(jī)污染富集濃縮方法。固相萃�。╯olid phase extract，SPE）技術(shù)是分離、富集和檢測境樣品中痕量有機(jī)污染物物經(jīng)常采用的方法之一。SPE 技術(shù)具兼有凈化和富集作用，而且有機(jī)溶劑使用量少，近年來，SPE 技術(shù)廣泛用于環(huán)境樣品的預(yù)處理。1.3.1 活化 SPE 柱由于 TCEP 具有一定的極性，本研究中采用 Waters Oasis HLB 固相萃取柱Waters Oasis HLB 填料是由親脂性二乙烯苯（divinylbenzene）和親水性 N-乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone）兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物。HLB 固相萃取柱通過反相的保留機(jī)理，利用“特殊的極性捕獲基團(tuán)”來增加對性物質(zhì)（如 TCEP）的保留。向 SPE 柱內(nèi)依次加入甲醇、乙腈和超純水各 6mL，自行通過 SPE 柱。在活
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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1 鐘大放;李高;劉昌孝;;生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則(草案)[J];藥物評價(jià)研究;2011年06期

2 歐育湘;;我國有機(jī)磷阻燃劑產(chǎn)業(yè)的分析與展望[J];化工進(jìn)展;2011年01期

3 王曉偉;劉景富;陰永光;;有機(jī)磷酸酯阻燃劑污染現(xiàn)狀與研究進(jìn)展[J];化學(xué)進(jìn)展;2010年10期

4 伍一軍,冷欣夫;三甲基苯基磷酸酯對神經(jīng)毒性酯酶的抑制及其酶促動(dòng)力學(xué)分析[J];生物化學(xué)雜志;1997年02期

本文編號(hào)：2656063