【摘要】：三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)是一種含氯有機磷酸酯類阻燃劑。它已廣泛用于塑料、紡織品、電子設備、建筑和家裝材料等產(chǎn)品。因TCEP與高分子材料是非共價鍵結(jié)合,故易從材料中釋放進入環(huán)境。目前,在空氣、降水、地表水、地下水、飲用水以及土壤樣品中均已檢出TCEP。但尚缺乏環(huán)境介質(zhì)中TCEP濃度的季節(jié)性變化特征的系統(tǒng)性報道。不過已有實驗研究表明,一定劑量TCEP(≥175mg/kg bw/d)處理Scl:dd Y雄性小鼠后,可檢出其肝腫瘤的形成;一定濃度TCEP(≥3.12mg/L)可引起人胚肝細胞L02和人肝腫瘤細胞Hep G2生長抑制、周期阻滯和衰老。多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)源于環(huán)境中有機物的不完全燃燒及熱分解過程,并廣泛分布于環(huán)境中,且性質(zhì)穩(wěn)定。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,Ba P)是多環(huán)芳烴中致癌性最強的一種化合物,它可在體內(nèi)經(jīng)細胞色素P450酶代謝,誘發(fā)氧化應激和炎性反應。Ba P是常見的高活性間接致癌物和突變原,已被國際癌癥研究中心列為確認致癌物。人體經(jīng)吸入空氣、飲水和攝食等多途徑復合暴露環(huán)境中TCEP和Ba P后其機體健康可受損害。不過,TCEP和Ba P的聯(lián)合毒性及其毒作用機制仍有待闡明。細胞炎性反應是環(huán)境污染物致機體健康損害的主要分子事件之一。研究表明,進入體內(nèi)的Ba P經(jīng)細胞色素P450酶系代謝活化后可激活白介素(Interleukin,IL)1、IL-6和IL-8等細胞炎性因子的分泌,影響肝腫瘤的發(fā)生與發(fā)展;用TCEP(175mg/kg bw/day和350mg/kg bw/day)飼養(yǎng)雄性B6C3F1小鼠兩年后可致其肝細胞嗜酸性小體發(fā)生率增加。但是,有關TCEP和Ba P聯(lián)合染毒所致細胞炎性反應的相關研究報道尚十分有限。本研究擬在課題組前期有關TCEP單獨染毒處理人胚肝細胞L02和人肝腫瘤細胞Hep G2的毒性研究基礎上,探究武漢市兩個主要自來水廠四季水樣(源水、出廠水和末梢水)有機提取物中TCEP濃度的季節(jié)性變化特點和細胞毒性,以及TCEP和Ba P聯(lián)合染毒對細胞的毒性效應及其可能的調(diào)控機制。本研究分為以下兩個部分:第一部分飲水有機提取物中TCEP濃度和細胞毒性目的:研究武漢市飲水有機提取物中TCEP濃度的季節(jié)性變化特點以及飲水有機提取物對肝細胞毒性和細胞凋亡的影響。方法:在四個季節(jié),采集武漢市兩個主要水廠(A水廠的源水為長江,B水廠的源水為漢江)的源水、出廠水和末梢水(共40個水樣)。用固相萃取方法富集水中痕量有機污染物。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術檢測有機提取物中TCEP的濃度。設一定濃度(12.5m L/m L、25.0m L/m L、50.0m L/m L和100.0m L/m L)的水有機提取物和二甲基亞砜(溶劑對照,終濃度(V/V):0.1%)處理L02細胞24h和48h,用MTT實驗檢測細胞存活率,并用流式細胞術檢測細胞凋亡率。結(jié)果:在取自武漢市不同源水的自來水廠的四季水樣(包括源水、出廠水和末梢水)中TCEP檢出率達90%;A水廠的四季源水、出廠水和末梢水中TCEP檢出濃度范圍分別為:檢出限(method detection limit,MDL)或MDL~676ng/L、33~78ng/L和35~257ng/L;B水廠的四季源水、出廠水和末梢水中TCEP檢出濃度范圍分別為:MDL或MDL~505ng/L、MDL或MDL~104ng/L和MDL或MDL~130ng/L。冬季兩水廠源水中TCEP濃度(A水廠:676ng/L;B水廠:505ng/L)均高于其他季節(jié),秋季A水廠和春季B水廠的末梢水中TCEP檢出濃度最高,分別是257ng/L和130ng/L。兩水廠夏季源水有機提取物細胞毒性均高于其他季節(jié);兩水廠夏、秋季出廠水和末梢水的細胞毒性均高于春冬季。兩水廠的四季源水有機提取物最高濃度組(100.0m L/m L)均觀察到細胞凋亡率增高(P0.05)。結(jié)論:兩個自來水廠凈水處理工藝尚無法有效去除水中TCEP;兩水廠的四季源水中TCEP濃度均呈現(xiàn)“冬春季高,夏秋季低”的特點,兩水廠的四季源水有機提取物最高濃度組(100.0m L/m L)均可觀察到細胞發(fā)生凋亡。第二部分EGFR-ERK通路調(diào)控TCEP聯(lián)合Ba P致細胞炎性反應的機制目的:研究TCEP和Ba P聯(lián)合染毒致肝細胞炎性反應及EGFR-MAPK信號通路的相關調(diào)控機制。方法:用一定濃度的TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L或200.00mg/L)和50μM Ba P單染和聯(lián)合染毒Hep G2細胞24h和48h,同時設置DMSO溶劑對照組(終濃度(V/V):0.1%)。為評價TCEP致細胞毒性,MTT實驗用于檢測細胞存活率;選用相應試劑盒評價丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、氧基抗氧化能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)和羥基抗氧化能力(hydroxygen radical absorbance capacity,HORAC)等細胞氧化應激指標。用流式細胞術檢測細胞凋亡率。用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測細胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8的蛋白水平。用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)實驗檢測IL-6和IL-8的m RNA表達水平。用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(western blotting)檢測表皮生長因子受體(extracellular signal regulated protein kinase,EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、信號傳導子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)信號通路相關蛋白質(zhì)(EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK、STAT3、p-STAT3、p65和p-p65)的表達。用EGFR抑制劑(AG1478)、ERK抑制劑(U0126)或p38抑制劑(SB203580)預處理Hep G2細胞1h后,再用50mg/L TCEP和50μM Ba P單獨及聯(lián)合處理Hep G2細胞24h,檢測細胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8釋放水平、IL-6和IL-8的m RNA表達水平。結(jié)果:在24和48h觀察時點,與溶劑對照組相比,200mg/L TCEP單獨染毒、≥3.12mg/L TCEP和50μM Ba P聯(lián)合組顯現(xiàn)細胞存活率降低(P0.05),IL-6和IL-8的m RNA水平上調(diào)(P0.05),細胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8蛋白釋放增加(P0.05),一定濃度的TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L和50mg/L)分別與50μM Ba P聯(lián)合染毒Hep G2細胞24h和48h,可上調(diào)p-EGFR蛋白的表達(P0.05),≥3.12mg/L TCEP與50μM Ba P的聯(lián)合染毒上調(diào)了p-ERK和p-p38蛋白的表達(P0.05)。與對應濃度的TCEP單獨處理組比較,≥3.12mg/L TCEP和50μM Ba P聯(lián)合染毒致細胞存活率降低(P0.05),且IL-6和IL-8的m RNA水平上調(diào)及細胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8蛋白的釋放增加(P0.05);一定濃度TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L和50mg/L)和50μM Ba P聯(lián)合染毒上調(diào)了p-EGFR蛋白的表達(P0.05),≥3.12mg/L TCEP與50μM Ba P聯(lián)合染毒上調(diào)了p-ERK和p-p38蛋白的表達(P0.05)。與僅用TCEP(50mg/L)和Ba P(50μM)聯(lián)合染毒Hep G2細胞組相比,添加抑制劑(AG1478、U0126或SB203580)與TCEP(50mg/L)及Ba P(50μM)共培養(yǎng)細胞組的IL-6和IL-8在m RNA水平和細胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-8蛋白釋放水平均降低(P0.05);但是,AG1478與TCEP(50mg/L)及Ba P(50μM)共培養(yǎng)僅觀察到p-ERK蛋白表達呈顯著性降低(P0.05)。結(jié)論:TCEP和Ba P聯(lián)合染毒對細胞存活的影響可能大于TCEP或Ba P的單獨作用;EGFR-ERK信號通路可能參與了一定濃度TCEP與50μM Ba P聯(lián)合染毒激活肝細胞釋放炎性分子的調(diào)控。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文1mL 移液管準確量取 TCEP 標準中間液 B（103mg/L）至 100mL 棕色容量瓶，用乙腈定容，即配制成濃度為 10mg/L 的 TCEP 標準中間液 C。（4）TCEP 標準應用液的配制：如圖 1 所示，由 TCEP 標準中間液 C（10mg/L）用乙腈逐級稀釋成不同濃度的 TCEP 標準液。共設定了 6 個濃度梯度，分別是10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L 和 5000μg/L。所有標樣均注明濃度和配置日期，，貯存在 4 C 冰箱中備用，TCEP 標準貯備液有效期為 6 個月，TCEP 標準中間液和 TCEP 標準應用液有效期為 1 個月。

圖 2 水樣采集布點示意圖1.3 固相萃取水體中有機污染物濃度通常很低，因此檢測分析時應選擇恰當?shù)挠袡C污染富集濃縮方法。固相萃�。╯olid phase extract，SPE）技術是分離、富集和檢測境樣品中痕量有機污染物物經(jīng)常采用的方法之一。SPE 技術具兼有凈化和富集作用，而且有機溶劑使用量少，近年來，SPE 技術廣泛用于環(huán)境樣品的預處理。1.3.1 活化 SPE 柱由于 TCEP 具有一定的極性，本研究中采用 Waters Oasis HLB 固相萃取柱Waters Oasis HLB 填料是由親脂性二乙烯苯（divinylbenzene）和親水性 N-乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone）兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物。HLB 固相萃取柱通過反相的保留機理，利用“特殊的極性捕獲基團”來增加對性物質(zhì)（如 TCEP）的保留。向 SPE 柱內(nèi)依次加入甲醇、乙腈和超純水各 6mL，自行通過 SPE 柱。在活
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R114

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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本文編號：2656063