【摘要】：目的近年來由副溶血性弧菌引起的食品安全惡性事件頻發(fā),已經(jīng)成為了我國首要的食源性致病菌,因此建立對(duì)副溶血性弧菌的快速檢測(cè)方法,對(duì)實(shí)施食品安全監(jiān)控,預(yù)防由副溶血性弧菌引起的食品安全事件十分必要。現(xiàn)有的副溶血性弧菌檢測(cè)方法存在著食品樣品的基質(zhì)復(fù)雜,樣品中病原菌含量低,需要對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)雜費(fèi)時(shí)的的前處理和預(yù)增菌的問題,本課題旨在建立并優(yōu)化一種副溶血性弧菌的高效的樣品前富集方法,并結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),建立一種副溶血性弧菌的快速檢測(cè)體系。方法制備可特異性識(shí)別副溶血性弧菌的兔多克隆抗體、雞卵黃抗體和噬菌體展示多肽,將三者分別作為生物識(shí)別探針,包被于磁珠表面,應(yīng)用于免疫磁性分離技術(shù)中,從而制備出三種不同的免疫磁性復(fù)合物。根據(jù)免疫磁性復(fù)合物的用量、富集時(shí)間及富集效率進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)出最佳的免疫磁性復(fù)合物。結(jié)合免疫磁性分離技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),建立一種副溶血性弧菌的快速檢測(cè)體系,并對(duì)這種檢測(cè)體系進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果(1)以副溶血性弧菌滅活菌株作為抗原,免疫SPF級(jí)蛋雞,制備了雞卵黃抗體,并采用PEG-6000沉淀法純化抗體,采用iELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)和特異性,采用電泳及蛋白濃度定量試劑盒方法測(cè)定了抗體純度及蛋白含量。結(jié)果顯示,本課題制備的雞卵黃抗體效價(jià)為1:128000;特異性較好,能特異性識(shí)別副溶血性弧菌,而不能與糞腸球菌、阪崎腸桿菌、陰溝腸桿菌、克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、布氏檸檬酸桿菌、李斯特菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、大腸桿菌和奇異變形桿菌結(jié)合;抗體雜帶較少條帶清晰;抗體蛋白含量為7.318 mg/mL;(2)以副溶血性弧菌滅活菌株作為抗原,采用噬菌體展示技術(shù)從肽庫中淘選特異性結(jié)合副溶血性弧菌的多肽,經(jīng)三輪生物淘選程序后,隨機(jī)挑選10個(gè)噬菌體克隆,并計(jì)算每輪程序后的噬菌體回收率。采用ELISA方法檢測(cè)噬菌體克隆對(duì)副溶血性弧菌的結(jié)合能力,對(duì)陽性噬菌體克隆進(jìn)行DNA的提取及測(cè)序,結(jié)合其流行程度及ELISA結(jié)果,選擇與副溶血性弧菌親和力最強(qiáng)的噬菌體展示多肽合成及表征,用生物分子作用系統(tǒng)檢測(cè)其特異性。結(jié)果顯示,噬菌體淘選實(shí)驗(yàn)親和篩選效果較好,噬菌體回收率隨淘選輪數(shù)逐漸升高;挑取的10個(gè)噬菌體克隆均為陽性,且C1結(jié)合副溶血性弧菌能力最強(qiáng),對(duì)噬菌體克隆進(jìn)行DNA提取并測(cè)序,多肽V1對(duì)應(yīng)著多個(gè)噬菌體克隆,流行度最高,且C1對(duì)應(yīng)的多肽序列也是V1,故選取噬菌體展示多肽V1序列進(jìn)行合成,修飾以生物素以便其應(yīng)用;采用生物相互作用系統(tǒng)評(píng)價(jià)噬菌體展示多肽V1的特異性,該多肽特異性較好,能特異性識(shí)別副溶血性弧菌,而不能識(shí)別沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌及克雷伯氏菌;(3)將兔多克隆抗體、雞卵黃抗體和噬菌體展示多肽三者作為生物識(shí)別探針分別與磁珠偶聯(lián),制備三種免疫磁性復(fù)合物,對(duì)相應(yīng)的免疫磁性分離方法進(jìn)行優(yōu)化及比較。在磁珠用量方面,兔多克隆抗體-磁珠最佳用量需1.4 mg,雞卵黃抗體-磁珠需1.2 mg,而噬菌體展示多肽V1-磁珠只需0.3 mg;在富集時(shí)間方面,兔多克隆抗體-磁珠和雞卵黃抗體-磁珠均需要60 min,而噬菌體展示多肽V1-磁珠只需30 min;在富集效率方面,兔多克隆抗體-磁珠能夠達(dá)到73.20%,雞卵黃抗體抗體-磁珠能夠達(dá)到79.25%,噬菌體展示多肽-磁珠能夠高達(dá)90.49%,結(jié)果表明,在制備免疫磁性復(fù)合物方面,噬菌體展示多肽相對(duì)兩種抗體無論是在用量時(shí)間,還是富集效率上,都顯示了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇噬菌體展示多肽V1-IMS作為副溶血性弧菌檢測(cè)的前處理方法,進(jìn)行快速檢測(cè)體系的建立;(4)利用噬菌體展示多肽V1-IMS對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行富集分離,并聯(lián)合PCR擴(kuò)增方法,放大檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)副溶血性弧菌。結(jié)果表明,該檢測(cè)體系靈敏度高,特異型好,整個(gè)檢測(cè)體系在180 min內(nèi)能夠完成,對(duì)副溶血性弧菌純菌液或模擬樣本的最低檢測(cè)限均為10~2cfu/m L,且具有較好的特異性,能夠滿足對(duì)食品樣品中副溶血性弧菌快速靈敏的檢測(cè)的要求;結(jié)論本實(shí)驗(yàn)基于噬菌體展示技術(shù)和免疫磁分離技術(shù)建開發(fā)了一種高效特異的食品樣品前處理方法,并結(jié)合PCR建立了一種特異性好、靈敏度高且方便快速的副溶血性弧菌檢測(cè)方法,為副溶血性弧菌乃至其他食源性病原菌的快速檢測(cè)的奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2640033