【摘要】：目的有機磷化合物(Organophosphorus,OPs)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計全世界每年約有300萬人暴露于有機磷化合物。部分有機磷化合物能夠誘導遲發(fā)性神經(jīng)病變,稱為有機磷化合物誘導的遲發(fā)性神經(jīng)病(Organophosphorus-induced delayed neuropathy,OPIDN)。三鄰甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)是最早被鑒定為能夠誘導人類OPIDN的有機磷化合物。OPIDN的病理學特征為Wallerian樣變性,表現(xiàn)為神經(jīng)管和神經(jīng)絲的丟失,線粒體和囊泡等的堆積,這提示可能存在異常的蛋白質(zhì)降解機制。課題組前期通過TOCP染毒整體動物和離體細胞均發(fā)現(xiàn)細胞中自噬活性發(fā)生改變,提示自噬在OPIDN的發(fā)生過程中發(fā)揮一定作用。到目前為止,OPIDN發(fā)病機制的研究尚不透徹,自噬在OPIDN中發(fā)揮的具體作用及其機制并不明確。在本研究中我們利用TOCP染毒分化后的野生型和自噬缺陷型(Atg7-/-)小鼠神經(jīng)瘤母細胞(Neuro-2a,N2a),作為在該研究中有機磷神經(jīng)毒性的體外模型,并利用暴露于TOCP的羅曼母雞作為體內(nèi)模型,來探討自噬在TOCP引起Neuro-2a細胞軸突和細胞體損傷中的作用,以期揭示自噬與TOCP導致的神經(jīng)細胞損傷間的內(nèi)在關(guān)系。方法1.建立TOCP染毒N2a細胞模型野生型N2a細胞和自噬缺陷型(Atg7-/-)N2a細胞貼壁后,加入含10μM視黃酸(Retinoic acid,RA)的2%血清培養(yǎng)液誘導分化48h。分別使用0 μM、5μM、10 μM的TOCP處理誘導分化成功的兩種細胞,培養(yǎng)24h后到達染毒終點。2.形態(tài)學觀察細胞經(jīng)TOCP處理24 h后,每組中隨機選取20個視野進行顯微鏡下觀察(200 X),并拍照記錄。使用TCapture記錄每個視野中10個細胞的軸突長度,進行數(shù)據(jù)分析。3.細胞線粒體膜電位檢測使用JC-1線粒體膜電位測定試劑盒檢測N2a細胞的線粒體膜電位。將野生型N2a細胞和Atg7-/-細胞用不同濃度TOCP處理后,在37℃下加入JC-1染色工作液(5 μg/mL)孵育20分鐘后用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌。熒光顯微鏡下觀察染色細胞并拍照。熒光酶標儀檢測JC-1單體(綠色熒光,激發(fā)光490 nm,發(fā)射光530 nm)和JC-1聚合物(紅色熒光,激發(fā)光525 nm,發(fā)射光590 nm)熒光強度。4.蛋白免疫印跡實驗利用RIPA裂解液提取TOCP處理的野生型N2a細胞和Atg7-/-細胞全蛋白,檢測Wallerian變性相關(guān)蛋白NMNAT、SARM1、DLK等蛋白的表達,以及calpain降解系統(tǒng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、程序性壞死相關(guān)蛋白的表達變化。利用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction試劑盒提取細胞核蛋白樣品,檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)核因子蛋白表達水平。5.實時熒光定量PCRTRIzol法提取不同劑量處理的野生型N2a細胞和Atg7-/-細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用UPL熒光探針和實時熒光定量PCR檢測抗氧化基因的相對表達水平。6.動物實驗建立TOCP誘導動物OPIDN模型:選取30只健康成年羅曼母雞,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,隨機均分為5組,分別為對照組、1D、5D、10D、21D組。一次性經(jīng)口灌胃進行TOCP染毒,灌胃劑量為750mg/kg,對照組不做處理。每天觀察并記錄動物雙下肢的活動情況和步態(tài)變化,按照八級評分標準對母雞OPIDN臨床癥狀的進展進行評分。在TOCP染毒1天、5天、10天、21天時,斷頭處死相應(yīng)組別的動物,在冰袋上迅速取出動物的脊髓、脛神經(jīng)等部位。建立OPIDN干預(yù)動物模型:另取30只健康成年羅曼母雞,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,隨機均分為6組,分別為對照組、0D、1D、5D、10D、21D組。對照組不做任何處理,其余組別提前24h皮下注射PMSF,劑量為90mg/kg,再一次性經(jīng)口灌胃進行TOCP染毒,灌胃劑量為750mg/kg。每天觀察并記錄動物雙下肢的活動情況和步態(tài)變化,按照八級評分標準對母雞OPIDN臨床癥狀的進展進行評分。在TOCP染毒0天、1天、5天、10天、21天時,斷頭處死相應(yīng)組別的動物,在冰袋上迅速取出動物的脊髓、脛神經(jīng)等部位。提取脊髓、脛神經(jīng)組織總蛋白,利用蛋白免疫印跡實驗檢測Wallerian變性相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果1.Atg7基因敲除對TOCP誘導的N2a細胞軸突損傷的影響(1)TOCP處理對N2a細胞軸突的影響:TOCP處理引起分化的N2a細胞的軸突明顯縮短,軸突損傷隨著染毒劑量的升高而增加。Atg7基因敲除對TOCP誘導N2a細胞產(chǎn)生的軸突損傷具有保護作用。(2)促軸突存活因子與促軸突損傷因子蛋白表達的變化:TOCP染毒后,野生型細胞和Atg7-/-細胞中NMNAT2和SCG10的蛋白水平均顯著下降,而SARM1和p-CRMP2的蛋白表達含量均呈現(xiàn)劑量依賴性增加。在相同劑量的TOCP暴露下,Atg7-/-細胞中NMNAT2和SCG10蛋白的表達含量均高于野生型細胞,SARM1蛋白的表達均低于野生型細胞。結(jié)果提示Atg7基因敲除能夠減緩TOCP誘導N2a細胞中促軸突存活因子水平的下降和促軸突損傷因子水平的升高。(3)DLK-MKK4-MAPK信號通路分子蛋白表達的變化:DLK和p-MKK4的蛋白水平在野生型細胞和Atg7-/-細胞中均明顯增加,且p-P38和p-ERK1/2蛋白表達也增多。結(jié)果提示TOCP處理后N2a細胞中DLK-MKK4-MAPK信號通路被激活。(4)動物模型中Wallerian變性相關(guān)分子蛋白表達的變化:TOCP模型組的動物自第五天起,實驗組動物雙下肢開始出現(xiàn)輕微變化,行走偶有搖晃。OPIDN的癥狀進展迅速,動物雙下肢力量越來越弱,行走協(xié)調(diào)度變差,腳步成外八字形,搖晃逐漸加劇甚至出現(xiàn)跌倒。到第15天時所有動物都完全癱瘓,此狀態(tài)一直持續(xù)直到實驗結(jié)束,未出現(xiàn)好轉(zhuǎn)或恢復。對照組動物在實驗期間未出現(xiàn)任何異常變化。PMSF干預(yù)組動物在實驗期間站立和行走狀態(tài)正常,未出現(xiàn)OPIDN癥狀。TOCP染毒模型脊髓與脛神經(jīng)中p-MKK4(或SARM1)、p-JNK的水平均呈現(xiàn)時間依賴性的增加。,而在PMSF干預(yù)組脊髓和脛神經(jīng)中p-MKK4、p-JNK的蛋白水平各組之間差異不具有統(tǒng)計學意義。(5)Calpain降解系統(tǒng)蛋白表達水平的變化:10μMTOCP染毒后,兩種細胞中m-calpain和μ-calpain的蛋白表達量均上升,Calpastain蛋白的表達則呈現(xiàn)劑量依賴性的降低。結(jié)果支持TOCP誘導N2a細胞中calpain降解系統(tǒng)激活。2.Atg7基因敲除對TOCP誘導的N2a細胞體損傷的影響(1)細胞線粒體膜電位的變化:TOCP染毒引起兩種細胞中紅色熒光強度與綠色熒光強度的比值明顯下降,線粒體膜電位下降,提示線粒體受到損傷。與野生型細胞相比,Atg7基因敲除能顯著減輕TOCP誘導的N2a細胞線粒體損傷。(2)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達水平的變化:TOCP處理后,ATF6、CHOP在兩種細胞中均呈現(xiàn)劑量依賴性增加。ATF4、p-eIF2a在野生型N2a細胞,10μM TOCP染毒組中的表達水平比對照組顯著升高,但在Atg7-/-細胞中沒有明顯變化。(3)抗氧化相關(guān)分子表達的變化:給予TOCP染毒后N2a細胞中抗氧化基因的mRNA的表達均呈現(xiàn)劑量依賴性增加,而且在Atg7-/-細胞中mRNA的表達水平明顯高于野生型N2a細胞。(4)細胞程序性壞死相關(guān)分子表達水平的變化:在野生型N2a細胞中RIP1和p-MLKL的表達水平都隨TOCP劑量增大而升高,均高于在Atg7-/-細胞中的表達水平。給予TOCP后,N2a細胞中程序性壞死被激活,Atg7基因敲除對TOCP誘導的程序性壞死具有保護作用。結(jié)論1.TOCP誘導神經(jīng)細胞產(chǎn)生軸突損傷,Atg7基因敲除對TOCP誘導神經(jīng)細胞軸突和細胞體的損傷具有保護作用。2.TOCP誘導N2a細胞軸突損傷,與Wallerian變性中促軸突存活因子的消耗、促軸突損傷因子的增加有關(guān),與Wallerian變性上游通路和calpain降解系統(tǒng)的激活有關(guān)。Atg7基因敲除能夠緩解促軸突存活因子的消耗和促軸突損傷因子的增加。3.TOCP誘導N2a細胞胞體損傷,與誘導細胞內(nèi)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體損傷、激活程序性壞死反應(yīng)有關(guān)。Atg7基因敲除能夠緩解TOCP誘導細胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的損傷。
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記的可溶性小分子蛋要；－溶酶解（ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｌｙｓｏｓｏｍａｌ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）：主要負責清除一些長壽蛋白、蛋白聚合物，逡逑以及受損的細胞器等；③胞漿蛋白降解系統(tǒng)；如ｃａｌｐａｉｎｓ鈣蛋白酶降解系統(tǒng)。逡逑自噬是真核細胞中高度保守的自我降解過程。當細胞受到營養(yǎng)缺乏或其他環(huán)逡逑境刺激時，便會啟動自噬過程并將不需要的蛋白質(zhì)和受損細胞器運輸?shù)饺苊阁w中逡逑進行降解［２８，３５］。一般根據(jù)細胞內(nèi)自噬底物運送到溶酶體腔方式的不同，將自噬分逡逑為大自嗟（Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）、小自嗤（Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）、分子伴侶介導的自嗤逡逑（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ，邋ＣＭＡ）邋［３６］。在小自嗤發(fā)生過程中，細胞利用內(nèi)逡逑陷或者凸起的溶酶體膜，來直接捕獲降解底物，ＣＭＡ需要分子伴侶蛋白識別和逡逑轉(zhuǎn)運可溶性蛋白質(zhì)到溶酶體內(nèi)降解，而大自噬的過程中會形成雙層的自噬體逡逑（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ），自嗤體最終和溶酶體融合后降解底物，這是與其他兩種自嗤逡逑的最大不同［３５，３６］。通常說的自噬指的就是大自噬。逡逑

邐山東大學碩士學位論文邐逡逑降解［３７］。在自噬的起始階段，由Ａｔｇｌ／ＵＬＫｌ激酶及其調(diào)節(jié)因子Ａｔｇｌ３、Ａｔｇｌ７來逡逑接受上游信號，如ｍＴＯＲ激酶的刺激，并與ＦＩＰ２００、ＡｔｇｌＯｌ形成復合物，該復逡逑合物轉(zhuǎn)運至成核區(qū)后可以募集其他相關(guān)的蛋白［３８］。自噬囊泡的形成是３－磷酸磷逡逑脂酰肌醇ＰＩ３Ｐ依賴性的，需要Ｖｐｓ３４／ＰＩ３Ｋ復合物來介導［３８］。Ａｔｇｌ２－Ａｔｇ５－Ａｔｇｌ６Ｌ逡逑復合物和邋Ａｔｇ８／ＬＣ３邋（微管蛋白輕鏈邋３，邋Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ邋３邋）逡逑系統(tǒng)參與自噬囊泡膜的延長，使其逐漸閉合形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體％。在逡逑Ａｔｇ８／ＬＣ３系統(tǒng)中，ＬＣ３在Ａｔｇ４催化下形成ＬＣ３邋Ｉ，ＬＣ３邋Ｉ在Ａｔｇ３和Ａｔｇ７作用下，逡逑與a愔Ｒ掖及罰ǎ校瑁錚螅穡瑁幔簦椋洌歟澹簦瑁幔睿錚歟幔恚椋睿澹校牛┙岷閑緯懾澹蹋茫常桑桑郟常浮�。ＬＣ３Ｉ劐的伭x鮮坑胱允商逍緯傻某潭扔泄兀�，常作为自噬体含量抵\曛鏡鞍祝郟常福常梗蕁Ｐ律傻淖藻義鮮商逡覽的ど系耐淮ト諍系鞍祝保峰澹ǎ櫻睿簦幔椋睿歟罰�、盐ＡＰ与溶酶剔熛的｀嵙ＭＰ８辶x細階諾鞍捉岷賢瓿勺允扇苊柑宓男緯桑婧笞允傻孜鎘扇苊柑逅餉附到猓郟矗選�。辶x

本文編號：2639818