【摘要】：目的β腎上腺素受體激動劑(簡稱β受體激動劑)在食品中的非法添加一直是影響中國居民健康的熱點問題之一,尤其多種β受體激動劑的混合使用以及新型結構類似物的出現(xiàn),引起居民對食品安全問題的恐慌,并且增加了市場監(jiān)管的難度。因此,β受體激動劑多殘留快速檢測技術成為社會發(fā)展的新需求。該研究主要利用分子對接技術將人工表達的β_2腎上腺素受體(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)和熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)與β受體激動劑分別進行分子對接,比較他們結合能力的差異性,探索HSP27用于β受體激動劑多殘留檢測的可能性。方法1.將HSP27和β_2AR分別與β受體激動劑類小分子藥物進行分子對接,比較它們與β受體激動劑類小分子藥物結合能力的差異性。2.將β_2AR基因轉入大腸桿菌BL21,表達出具有功能活性的β_2AR蛋白,對誘導表達條件進行優(yōu)化,并對表達的β_2AR蛋白進行純化。3.將HSP27基因轉入大腸桿菌BL21,表達出具有功能活性的HSP27蛋白,對誘導表達條件進行優(yōu)化,并對表達的HSP27蛋白進行純化。4.ELISA方法對β_2AR和HSP27與β受體激動劑類小分子藥物結合能力進行驗證。5.將HSP27用于檢測3種β受體激動劑類小分子藥物,建立標準曲線,計算檢出限值,探索HSP27用于β受體激動劑多殘留檢測方面的可能性。結果1.分子對接結果克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅三種β受體激動劑分別與HSP27和β_2AR的對接模型圖顯示:在其形成的“配基結合小袋”中,HSP27和β_2AR與β受體激動劑類小分子藥物依靠疏水鍵和氫鍵相互作用。15組對接結果中9組HSP27的分子對接總評分值高于β_2AR。配對t檢驗分析它們結合能力的差異性具有統(tǒng)計學意義(P=0.03)。2.β_2AR蛋白的表達與純化結果重組β_2AR基因在大腸桿菌BL21中成功表達出β_2AR蛋白,蛋白大小為47KD左右,誘導表達條件:在細菌生長對數(shù)期(OD=0.6~0.9)加入濃度為1.0mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振蕩培養(yǎng)16 h。經超聲破碎、離心后留取上清,在濃度為300 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。3.HSP27蛋白的表達與純化結果HSP27基因在大腸桿菌BL21中成功表達出HSP27蛋白,蛋白大小為27 KD左右,誘導表達條件:在細菌生長對數(shù)期(OD=0.6~0.9)加入濃度為0.8 mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振蕩培養(yǎng)16 h。經超聲破碎、離心后留取上清,在濃度為250 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。4.ELISA活性鑒定結果ELISA方法進行其活性鑒定,結果表明:HSP27蛋白和β_2AR蛋白與克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅三種β受體激動劑的酶標記物均能夠發(fā)生特異性反應,HSP27的OD值分別為0.685,0.662和0.525。β_2AR的OD值分別為0.448、0.320和0.362。5.HSP27在β受體激動劑檢測方面的應用HSP27用于3種β受體激動劑類藥物檢測的結果顯示,在1μg/L~1000μg/L范圍內,HSP27與3種β受體激動劑具有較好的線性關系,萊克多巴胺和非諾特羅與克倫特羅交叉反應率分別為52.6%和29.7%,檢出限值為1.53μg/L�？藗愄亓_、萊克多巴胺和非諾特羅的添加回收率范圍分別為52.7%~77.3%,51.7%~71.3%和52%~76.8%,重復試驗中變異系數(shù)均小于15%,表明HSP27在3種β受體激動劑類藥物檢測中具有較好的重復性。結論通過分子對接技術,本研究發(fā)現(xiàn)HSP27與β受體激動劑具有較強的結合能力,并發(fā)現(xiàn)HSP27在β受體激動劑的多殘留檢測方面的作用,為β受體激動劑的多殘留檢測技術的建立提供新的思路和理論依據。
【圖文】：

3 結果3.1 分子對接結果3.1.1 分子對接模擬圖分析15 種 β 受體激動劑類小分子藥物在 SYBYL 軟件中按事先設定的程序，分別與 HSP27 和 β2AR 進行分子對接，并在 15 種 β 受體激動劑中選取 3 種具有代表性的小分子藥物，分別是克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅，ELISA 對對接結果進行驗證。15 種 β 受體激動劑類小分子藥物分別與 HSP27 和 β2AR 的分子對接模型圖如圖 3.1 和 3.2 所示，β 受體激動劑類小分子藥物與 HSP27 和 β2AR大分子結構分別在其大分子結構形成的“配基結合小袋”中依靠疏水鍵和氫鍵相互作用，但同種 β 受體激動劑在 HSP27 和 β2AR 大分子結構中結合形態(tài)不同。

別與 HSP27 和 β2AR 進行分子對接，并在 15 種 β 受體激動劑中選取 3 種具有代表性的小分子藥物，分別是克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅，ELISA 對對接結果進行驗證。15 種 β 受體激動劑類小分子藥物分別與 HSP27 和 β2AR 的分子對接模型圖如圖 3.1 和 3.2 所示，，β 受體激動劑類小分子藥物與 HSP27 和 β2AR大分子結構分別在其大分子結構形成的“配基結合小袋”中依靠疏水鍵和氫鍵相互作用，但同種 β 受體激動劑在 HSP27 和 β2AR 大分子結構中結合形態(tài)不同。A B C圖 3.1 HSP27 與 β 受體激動劑類藥物分子對接模型圖注：A：HSP27 與克倫特羅；B： HSP27 與萊克多巴胺；C：HSP27 與非諾特羅
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R155.5

【參考文獻】

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本文編號：2634421