【摘要】：目的β腎上腺素受體激動(dòng)劑(簡稱β受體激動(dòng)劑)在食品中的非法添加一直是影響中國居民健康的熱點(diǎn)問題之一,尤其多種β受體激動(dòng)劑的混合使用以及新型結(jié)構(gòu)類似物的出現(xiàn),引起居民對食品安全問題的恐慌,并且增加了市場監(jiān)管的難度。因此,β受體激動(dòng)劑多殘留快速檢測技術(shù)成為社會(huì)發(fā)展的新需求。該研究主要利用分子對接技術(shù)將人工表達(dá)的β_2腎上腺素受體(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)和熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)與β受體激動(dòng)劑分別進(jìn)行分子對接,比較他們結(jié)合能力的差異性,探索HSP27用于β受體激動(dòng)劑多殘留檢測的可能性。方法1.將HSP27和β_2AR分別與β受體激動(dòng)劑類小分子藥物進(jìn)行分子對接,比較它們與β受體激動(dòng)劑類小分子藥物結(jié)合能力的差異性。2.將β_2AR基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,表達(dá)出具有功能活性的β_2AR蛋白,對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,并對表達(dá)的β_2AR蛋白進(jìn)行純化。3.將HSP27基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,表達(dá)出具有功能活性的HSP27蛋白,對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,并對表達(dá)的HSP27蛋白進(jìn)行純化。4.ELISA方法對β_2AR和HSP27與β受體激動(dòng)劑類小分子藥物結(jié)合能力進(jìn)行驗(yàn)證。5.將HSP27用于檢測3種β受體激動(dòng)劑類小分子藥物,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算檢出限值,探索HSP27用于β受體激動(dòng)劑多殘留檢測方面的可能性。結(jié)果1.分子對接結(jié)果克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅三種β受體激動(dòng)劑分別與HSP27和β_2AR的對接模型圖顯示:在其形成的“配基結(jié)合小袋”中,HSP27和β_2AR與β受體激動(dòng)劑類小分子藥物依靠疏水鍵和氫鍵相互作用。15組對接結(jié)果中9組HSP27的分子對接總評分值高于β_2AR。配對t檢驗(yàn)分析它們結(jié)合能力的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。2.β_2AR蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果重組β_2AR基因在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)出β_2AR蛋白,蛋白大小為47KD左右,誘導(dǎo)表達(dá)條件:在細(xì)菌生長對數(shù)期(OD=0.6~0.9)加入濃度為1.0mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振蕩培養(yǎng)16 h。經(jīng)超聲破碎、離心后留取上清,在濃度為300 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。3.HSP27蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果HSP27基因在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)出HSP27蛋白,蛋白大小為27 KD左右,誘導(dǎo)表達(dá)條件:在細(xì)菌生長對數(shù)期(OD=0.6~0.9)加入濃度為0.8 mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振蕩培養(yǎng)16 h。經(jīng)超聲破碎、離心后留取上清,在濃度為250 mmol/L咪唑洗脫液下純化出蛋白。4.ELISA活性鑒定結(jié)果ELISA方法進(jìn)行其活性鑒定,結(jié)果表明:HSP27蛋白和β_2AR蛋白與克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅三種β受體激動(dòng)劑的酶標(biāo)記物均能夠發(fā)生特異性反應(yīng),HSP27的OD值分別為0.685,0.662和0.525。β_2AR的OD值分別為0.448、0.320和0.362。5.HSP27在β受體激動(dòng)劑檢測方面的應(yīng)用HSP27用于3種β受體激動(dòng)劑類藥物檢測的結(jié)果顯示,在1μg/L~1000μg/L范圍內(nèi),HSP27與3種β受體激動(dòng)劑具有較好的線性關(guān)系,萊克多巴胺和非諾特羅與克倫特羅交叉反應(yīng)率分別為52.6%和29.7%,檢出限值為1.53μg/L�？藗愄亓_、萊克多巴胺和非諾特羅的添加回收率范圍分別為52.7%~77.3%,51.7%~71.3%和52%~76.8%,重復(fù)試驗(yàn)中變異系數(shù)均小于15%,表明HSP27在3種β受體激動(dòng)劑類藥物檢測中具有較好的重復(fù)性。結(jié)論通過分子對接技術(shù),本研究發(fā)現(xiàn)HSP27與β受體激動(dòng)劑具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,并發(fā)現(xiàn)HSP27在β受體激動(dòng)劑的多殘留檢測方面的作用,為β受體激動(dòng)劑的多殘留檢測技術(shù)的建立提供新的思路和理論依據(jù)。
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 分子對接結(jié)果3.1.1 分子對接模擬圖分析15 種 β 受體激動(dòng)劑類小分子藥物在 SYBYL 軟件中按事先設(shè)定的程序，分別與 HSP27 和 β2AR 進(jìn)行分子對接，并在 15 種 β 受體激動(dòng)劑中選取 3 種具有代表性的小分子藥物，分別是克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅，ELISA 對對接結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。15 種 β 受體激動(dòng)劑類小分子藥物分別與 HSP27 和 β2AR 的分子對接模型圖如圖 3.1 和 3.2 所示，β 受體激動(dòng)劑類小分子藥物與 HSP27 和 β2AR大分子結(jié)構(gòu)分別在其大分子結(jié)構(gòu)形成的“配基結(jié)合小袋”中依靠疏水鍵和氫鍵相互作用，但同種 β 受體激動(dòng)劑在 HSP27 和 β2AR 大分子結(jié)構(gòu)中結(jié)合形態(tài)不同。

別與 HSP27 和 β2AR 進(jìn)行分子對接，并在 15 種 β 受體激動(dòng)劑中選取 3 種具有代表性的小分子藥物，分別是克倫特羅、萊克多巴胺和非諾特羅，ELISA 對對接結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。15 種 β 受體激動(dòng)劑類小分子藥物分別與 HSP27 和 β2AR 的分子對接模型圖如圖 3.1 和 3.2 所示，，β 受體激動(dòng)劑類小分子藥物與 HSP27 和 β2AR大分子結(jié)構(gòu)分別在其大分子結(jié)構(gòu)形成的“配基結(jié)合小袋”中依靠疏水鍵和氫鍵相互作用，但同種 β 受體激動(dòng)劑在 HSP27 和 β2AR 大分子結(jié)構(gòu)中結(jié)合形態(tài)不同。A B C圖 3.1 HSP27 與 β 受體激動(dòng)劑類藥物分子對接模型圖注：A：HSP27 與克倫特羅；B： HSP27 與萊克多巴胺；C：HSP27 與非諾特羅
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2634421