【摘要】：研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是工業(yè)上常用的有機(jī)溶劑之一,通常作為金屬部件和電子元件脫脂劑和去污清洗劑而被廣泛應(yīng)用于電鍍、五金、電子等行業(yè)。長(zhǎng)期暴露于TCE的工人可能會(huì)引起職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎(occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,ODMLT),該病主要癥狀為嚴(yán)重皮疹、發(fā)熱、肝損害和淺淋巴結(jié)腫大,其中嚴(yán)重的肝損傷是患者死亡的主要原因之一。前期研究表明補(bǔ)體激活參與了三氯乙烯致敏小鼠免疫性肝損傷,肝臟組織存在MAC沉積,且肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯裂解死亡,由此可知MAC可能發(fā)揮亞裂解作用介導(dǎo)肝臟損傷。亞裂解水平的MAC能夠激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路,加重炎癥反應(yīng)。MAC能夠引起平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路的活化。TCE致敏小鼠肝臟組織中沉積的MAC是否通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的活化介導(dǎo)免疫性肝臟損傷有待研究。研究目的通過(guò)建立三氯乙烯致敏小鼠模型,采用腹腔注射重組蛋白sCD59-Cys抑制MAC的沉積,檢測(cè)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59a的表達(dá)水平、MAC沉積水平、NF-κB信號(hào)通路活化及肝臟損傷的情況,探討MAC在三氯乙烯致敏小鼠免疫性肝損傷中的作用及可能機(jī)制。研究方法6-8周無(wú)特定病原體級(jí)雌性BALB/c小鼠(n=89),適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=5),溶劑對(duì)照組(n=5),sCD59-Cys對(duì)照組(n=5),TCE處理組(n=50),TCE+sCD59-Cys處理組(n=24)。建立TCE致敏BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?末次激發(fā)后24 h根據(jù)皮膚致敏反應(yīng)評(píng)分將小鼠分為致敏組和未致敏組,分別于末次激發(fā)后24 h、72 h和7 d處死小鼠。收集血清和肝臟組織。采用HE染色觀察小鼠肝臟病理改變,生化試劑盒檢測(cè)肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine amiotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST),實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)TNF-α和IL-1βmRNA水平,免疫印跡法檢測(cè)肝臟CD59a、P-IκBα和核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝臟CD59a分布情況和MAC沉積水平。結(jié)果1.致敏情況空白對(duì)照、溶劑對(duì)照組以及sCD59-Cys對(duì)照組小鼠背部皮膚均未出現(xiàn)紅斑、水腫。TCE處理組致敏率為19/50(38.0%),TCE+sCD59-Cys處理組致敏率為10/24(41.7%)。2.TCE致敏小鼠肝臟損傷組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,空白對(duì)照和溶劑對(duì)照組小鼠肝臟組織未出現(xiàn)病理學(xué)改變;TCE致敏24 h組和72 h組肝臟發(fā)生病變,72 h組更為嚴(yán)重,肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變性,TCE致敏7 d組肝臟組織恢復(fù)正常。肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組小鼠相比,溶劑對(duì)照組小鼠血清ALT、AST水平無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏24 h、72 h組ALT、AST水平升高,其中72 h時(shí)達(dá)到峰值(P0.05),7 d時(shí)恢復(fù)(P0.05)。3.TCE致敏小鼠肝臟TNF-α和IL-1βmRNA水平升高實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,溶劑對(duì)照組小鼠肝臟組織TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)明顯差異(P0.05),TCE致敏24 h、72 h組TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(P0.05),均在72 h達(dá)到峰值(P0.05),7 d時(shí)恢復(fù)(P0.05)。4.TCE致敏小鼠肝臟CD59a表達(dá)水平降低免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示,空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組小鼠肝臟組織細(xì)胞表面CD59a廣泛表達(dá),呈條索狀分布,TCE致敏小鼠肝臟組織細(xì)胞表面CD59a表達(dá)降低,在72 h時(shí)表達(dá)最低,7 d時(shí)恢復(fù)。免疫印跡結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,溶劑對(duì)照組CD59a蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏24 h、72 h組CD59a蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05),在72 h時(shí)降到最低,7 d時(shí)恢復(fù)(P0.05)。5.TCE致敏小鼠肝臟MAC沉積水平升高免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示,空白對(duì)照和溶劑對(duì)照組小鼠肝臟組織無(wú)MAC沉積;與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏24 h、72 h組肝臟組織有明顯可見(jiàn)MAC沉積,且在72 h最為明顯,組化評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏7 d組肝臟組織MAC沉積水平無(wú)明顯差異(P0.05)。6.sCD59-Cys減輕TCE致敏小鼠肝臟損傷組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,溶劑對(duì)照組和sCD59-Cys對(duì)照組小鼠肝臟組織未出現(xiàn)病理學(xué)改變;與TCE致敏72 h組相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h組肝臟組織病理學(xué)改變明顯減輕,肝細(xì)胞水腫減輕。肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示,與溶劑對(duì)照組相比,sCD59-Cys對(duì)照組小鼠血清ALT、AST水平無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),TCE+sCD59-Cys致敏72 h組ALT、AST水平明顯升高(P0.05);與TCE致敏72 h組相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h組ALT、AST水平明顯降低(P0.05)。7.sCD59-Cys降低TCE致敏小鼠肝臟MAC沉積水平免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示,sCD59-Cys對(duì)照組小鼠肝臟組織無(wú)MAC沉積;與溶劑對(duì)照組相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h組有明顯可見(jiàn)MAC沉積,組化評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但與TCE致敏72 h組相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h組肝臟組織MAC沉積水平明顯降低,組化評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.sCD59-Cys抑制TCE致敏小鼠肝臟NF-κB信號(hào)通路及炎癥水平免疫印跡結(jié)果顯示,溶劑對(duì)照組和sCD59-Cys對(duì)照組小鼠肝臟組織P-IκBα及核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏72 h組和TCE+sCD59-Cys致敏72 h組肝臟組織P-IκBα及核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05);與TCE致敏72 h組相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h組肝臟組織P-IκBα及核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示,與溶劑對(duì)照組相比,sCD59-Cys對(duì)照組小鼠肝臟組織TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)明顯差異(P0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h組肝臟組織TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(P0.05);與TCE致敏72 h組相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h組肝臟組織TNF-α和IL-1βmRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(P0.05)。結(jié)論1.補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59a參與了TCE致敏小鼠免疫性肝損傷過(guò)程;2.TCE致敏小鼠免疫性肝損傷過(guò)程中存在NF-κB信號(hào)通路的活化;3.重組蛋白sCD59-Cys可能通過(guò)抑制MAC的形成進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路活化發(fā)揮對(duì)TCE致敏小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R135

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2633139