【摘要】：研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是一種常用的有機(jī)溶劑,在工業(yè)上廣泛應(yīng)用已有100多年的歷史,不僅作為高分子化合物的原料之一,且被廣泛應(yīng)用于五金、玩具、電子等行業(yè)用作金屬部件和電子元件清洗劑。TCE的應(yīng)用也很難找到其他較好的替代品,加之接觸毒物工人缺乏有效的防護(hù),TCE接觸已成為我國(guó)工人健康危害的突出問(wèn)題。我國(guó)2005年制定的職業(yè)病診斷標(biāo)準(zhǔn)已將其命名為“職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎”(occupational medicamentosa-like dermatitis due to TCE,OMLDT)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)OMLDT的臨床表現(xiàn)不僅有嚴(yán)重的全身性皮膚損害,同時(shí)肝功能衰竭為死亡的重要原因之一。因此,肝臟損傷在OMLDT的防治引起了國(guó)內(nèi)職業(yè)衛(wèi)生醫(yī)師及臨床治療醫(yī)師的廣泛關(guān)注。關(guān)于OMLDT及其免疫性肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制,目前仍不清楚,多數(shù)研究認(rèn)為是抗原特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型IV型變態(tài)反應(yīng),隨著TCE誘導(dǎo)免疫性肝臟損傷發(fā)病機(jī)制的深入探討,發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)IV型變態(tài)反應(yīng)不能完全解釋其發(fā)病機(jī)制,但相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體激活可能在OMLDT免疫性肝損傷中發(fā)揮一定的作用,激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kinin System,KKS)與補(bǔ)體系統(tǒng)有較強(qiáng)的生物相關(guān)性,有研究發(fā)現(xiàn)TCE致敏陽(yáng)性豚鼠肝臟可見(jiàn)肝竇Kupffer細(xì)胞增多,Kupffer細(xì)胞活化及其炎癥因子表達(dá)改變?cè)赥CE免疫性肝臟損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用,然而,在此過(guò)程中Kupffer細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制尚不明確,有研究發(fā)現(xiàn)BK與其受體B2R結(jié)合均可以激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)和STAT3信號(hào)通路,們推測(cè)TCE致免疫性肝臟損傷過(guò)程中,KKS系統(tǒng)活化產(chǎn)物BK與其受體結(jié)合激活MAPK信號(hào)通路,使肝臟Kupffer細(xì)胞分泌促炎及抗炎細(xì)胞因子發(fā)生改變,進(jìn)一步放大細(xì)胞免疫反應(yīng),參與肝臟的免疫性損傷過(guò)程。研究目的采用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并結(jié)合Kupffer細(xì)胞分離技術(shù)和檢測(cè)技術(shù),使用KKS系統(tǒng)抑制劑PKSI-527和B2R特異性抑制劑HOE-140研究BK與受體B2R結(jié)合激活MAPK通路后對(duì)肝臟Kupffer細(xì)胞炎性因子分泌的影響,并結(jié)合體外分離培養(yǎng)TCE致敏小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞,從正反兩個(gè)方面測(cè)定Kupffer細(xì)胞MAPK信號(hào)通路改變及其產(chǎn)生的炎性因子的變化情況,對(duì)TCE免疫性肝臟損傷的機(jī)制進(jìn)行探討。本研究成果將為TCE誘導(dǎo)免疫性肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù),服務(wù)于OMLDT的防治工作。第一部分激肽釋放酶激肽系統(tǒng)在三氯乙烯致敏小鼠體內(nèi)活化研究研究方法建立TCE經(jīng)皮致敏BALB/c小鼠模型,使用激肽釋放酶激肽高選擇性抑制劑PKSI-527預(yù)處理致敏小鼠,觀察各組小鼠血漿和肝臟中KKS系統(tǒng)相關(guān)蛋白指標(biāo)的表達(dá)情況。使用ELISA檢測(cè)小鼠血漿中BK、PK和HMWK的表達(dá)水平,免疫熒光檢測(cè)各組小鼠肝臟中KKS系統(tǒng)活化產(chǎn)物BK及其受體表達(dá)情況。探討KKS系統(tǒng)在TCE致敏小鼠體內(nèi)和肝臟中的活化和表達(dá)情況。結(jié)果1.小鼠模型皮膚致敏情況本次建模過(guò)程,各組小鼠未有動(dòng)物死亡,觀察空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組小鼠,背部皮膚均未有紅斑和水腫出現(xiàn)。TCE致敏組小鼠背部皮膚出現(xiàn)不同程度的紅斑和水腫,水腫嚴(yán)重者出現(xiàn)皮膚隆起,用200μl槍頭觸之,皮膚水腫增厚明顯,TCE未致敏小鼠皮膚未發(fā)現(xiàn)明顯紅斑和水腫。2.各組小鼠致敏率分析TCE處理組小鼠,60只TCE處理組小鼠中有24只致敏,其中皮膚評(píng)分為1的11只,評(píng)分為2的9只,評(píng)分為3的4只,另36只未致敏,致敏率達(dá)40%;60只TCE+PKSI-527處理組小鼠中有13只致敏,其中皮膚評(píng)分為1的7只,評(píng)分為2的3只,評(píng)分為3的3只,另47只未致敏,致敏率達(dá)21.67%。3.各組小鼠建模過(guò)程中體重改變情況建模過(guò)程中監(jiān)測(cè)各組小鼠體重變化,研究發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組小鼠體重變化穩(wěn)定,無(wú)明顯異常。在建模階段,TCE致敏組小鼠體重增長(zhǎng)較慢,第18d第一次激發(fā)后體重出現(xiàn)明顯的“V”型下陷,TCE+PKSI-527組小鼠體重改變與TCE處理組相似,但未有出現(xiàn)明顯的“V”型下陷。各組小鼠第20d的體重減去初始體重,計(jì)算建模階段體重改變差值,TCE致敏組小鼠體重變化與空白對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),TCE+PKSI-527組小鼠體重改變也明顯減少(P0.05)。4.各組小鼠肝臟系數(shù)變化動(dòng)物處死后,取各組小鼠肝臟,稱重,計(jì)算肝臟臟器系數(shù),統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與空白對(duì)照組相比,48h和72h TCE致敏組小鼠肝臟系數(shù)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí),48h和72h TCE+PKSI-527致敏組小鼠臟器系數(shù)也明顯升高。5.各組小鼠血漿PK、HMWK表達(dá)水平使用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血漿中PK和HMWK濃度,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組的小鼠血漿中PK水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,48h和72h TCE致敏組小鼠血漿PK濃度明顯升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),在24h、48h、72h和7d四個(gè)時(shí)點(diǎn)中,PK濃度在72h時(shí)點(diǎn)達(dá)到峰值;使用PKSI-527處理后,各組血漿PK濃度明顯降低,48h和72h TCE+PKSI-527致敏組小鼠血漿PK濃度明顯低于相應(yīng)TCE致敏組時(shí)點(diǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組的小鼠血漿中HMWK水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,24h和48h TCE致敏組小鼠血漿HMWK濃度明顯升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);使用PKSI-527處理后,各組血漿HMWK濃度明顯降低,48h TCE+PKSI-527致敏組小鼠血漿HMWK濃度明顯低于相應(yīng)TCE致敏組時(shí)點(diǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.各組小鼠血漿BK濃度使用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血漿BK表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);24h、48h和72h TCE致敏組小鼠血漿BK濃度與空白對(duì)照組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)BK表達(dá)水平在72h時(shí)點(diǎn)達(dá)到最高峰值,TCE+PKSI-527處理組各時(shí)點(diǎn)致敏小鼠血漿BK濃度較TCE致敏組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE+PKSI-527致敏組小鼠血漿BK濃度明顯降低。7.不同處理組肝臟B2R表達(dá)水平使用免疫熒光法檢測(cè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、72h TCE致敏組、72h TCE+PKSI-527致敏組小鼠肝臟組織中B2R的表達(dá)量,檢查發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟中B2R有少量表達(dá),72hTCE致敏組小鼠肝臟B2R表達(dá)量明顯增多,使用PKSI-527后,表達(dá)量有所下降。結(jié)論1.成功建立TCE經(jīng)皮致敏小鼠模型,小鼠首次激發(fā)后,體重有較為顯著的“V”型下陷趨勢(shì);2.TCE致敏小鼠體內(nèi)KKS系統(tǒng)活化,TCE致敏小鼠血漿中PK、HMWK、BK表達(dá)水平明顯升高;3.TCE致敏小鼠肝臟B2R表達(dá)升高,使用PKSI-527后,B2R表達(dá)量降低。第二部分緩激肽受體B2R調(diào)控Kupffer細(xì)胞活化介導(dǎo)三氯乙烯致免疫性肝損傷及機(jī)制研究研究方法研究一中,我們發(fā)現(xiàn)KKS系統(tǒng)活化及其活性產(chǎn)物BK和受體B2R在三氯乙烯致敏小鼠肝臟中表達(dá)增高,但其在其免疫性肝損傷的作用如何,具體機(jī)制尚不清楚。為了揭示TCE致敏小鼠免疫肝損傷中KKS活化的分子機(jī)制,我們?cè)谇捌趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步選擇特異性B2R拮抗劑HOE140,檢測(cè)BK/B2R信號(hào)通路對(duì)TCE致敏小鼠免疫肝損傷的影響;檢測(cè)TCE致敏BALB/c小鼠中Kupffer細(xì)胞活化情況,從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟中分離出Kupffer細(xì)胞,觀察MAPK和STAT3信號(hào)通路的激活及其相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況。結(jié)果1.各組小鼠致敏率分析各組小鼠在建模過(guò)程無(wú)死亡,根據(jù)表2的皮膚反應(yīng)評(píng)分,在第20天將小鼠分為致敏組和未致敏組。分別以TCE處理組和TCE+HOE140處理組進(jìn)行致敏率計(jì)算。TCE處理組致敏率39.58%(19/48),TCE+HOE140組致敏率32.69%(17/52),兩組致敏率之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.各組小鼠肝臟組織CD68表達(dá)CD68是一種高度糖基化的膜蛋白。當(dāng)Kupffer細(xì)胞被激活時(shí),CD68表達(dá)增加,并作為Kupffer細(xì)胞激活的標(biāo)志物,本研究使用IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟CD68+細(xì)胞數(shù)表達(dá)無(wú)明顯差異,且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TCE處理經(jīng)皮致敏后,與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比,24h和72h TCE致敏組肝臟中CD68+細(xì)胞數(shù)均明顯增加;同時(shí),與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比,24h和72h TCE+HOE140致敏組肝臟中CD68+細(xì)胞數(shù)也均明顯增加。TCE致敏組和TCE+HOE140致敏組相比,CD68+細(xì)胞數(shù)改變無(wú)明顯差異。3.各組小鼠肝臟組織CD16/CD32表達(dá)IHC法進(jìn)一步檢測(cè)M1型Kupffer細(xì)胞表面標(biāo)記物CD16/CD32的表達(dá),與CD68表達(dá)情況一致,空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟CD16/CD32+細(xì)胞數(shù)表達(dá)無(wú)明顯差異,且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TCE處理經(jīng)皮致敏后,與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比,24h和72h TCE致敏組肝臟中CD16/CD32+細(xì)胞數(shù)均明顯增加;同時(shí),與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比,24h和72h TCE+HOE140致敏組肝臟中CD16/CD32+細(xì)胞數(shù)也均明顯增加。TCE致敏組和TCE+HOE140致敏組相比,CD16/CD32+細(xì)胞數(shù)改變無(wú)明顯差異。4.各組小鼠肝臟組織B2R表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)TCE處理組肝臟損傷在72h時(shí)點(diǎn)最為嚴(yán)重,因此,我們選擇在72h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)B2R蛋白的表達(dá)。使用Western-blot法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織B2R的表達(dá)情況,研究發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組B2R有一定量的表達(dá),表達(dá)量較少,兩組表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。72h TCE致敏組肝臟B2R表達(dá)量明顯升高,與空白對(duì)照組相比,高出6~8倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);72h未致敏組B2R表達(dá)量與空白對(duì)照組相比,無(wú)明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);72h TCE致敏組與未致敏組相比,肝臟B2R表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);使用HOE140后,72h TCE+HOE140致敏組與空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和72h TCE+HOE140未致敏組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);同時(shí),72h TCE+HOE140致敏組與TCE致敏組相比,肝臟B2R表達(dá)量無(wú)明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.HOE140在TCE處理小鼠中的作用HOE140是B2R的特異性拮抗劑,使用熒光雙標(biāo)檢測(cè)BK和B2R的結(jié)合情況,研究發(fā)現(xiàn)TCE致敏組BK和B2R表達(dá)較多,且BK和B2R有結(jié)合現(xiàn)象(暗黃色),使用HOE140后,BK和B2R結(jié)合情況有所降低(紅色和綠色),結(jié)果顯示HOE140對(duì)B2R發(fā)揮了拮抗作用,效果明顯。6.各組小鼠肝臟損傷情況6.1肝功能檢測(cè)空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組各指標(biāo)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,24h、72h TCE致敏組AST明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與相應(yīng)的未致敏組相比,24h、72h TCE致敏組AST明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與空白對(duì)照組相比,24h TCE+HOE140致敏組AST明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),然而,與空白對(duì)照組相比,72h TCE+HOE140致敏組AST增高不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ALT檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);72h致敏組與空白對(duì)照組相比ALT明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與相應(yīng)的未致敏組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對(duì)照組相比,24h和72h TCE+HOE140致敏組ALT增高不明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.2超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)通過(guò)透射電鏡檢測(cè)觀察,空白對(duì)照組與空白對(duì)照組細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整,無(wú)明顯改變。24h和72h TCE致敏組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器消失,肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,線粒體消失,糖原顆粒明顯減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂,細(xì)胞核膜界限不清。同時(shí),24h和72h TCE+HOE140致敏組組織形態(tài)學(xué)改變減輕,肝細(xì)胞核糖體部分減少,少量線粒體發(fā)生空泡變性,72h TCE+HOE140致敏組大部分線粒體清晰。7.各組小鼠肝臟MAPK通路和STAT3蛋白表達(dá)情況7.1小鼠肝臟P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)水平Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟p-P38表達(dá)無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE致敏組72h TCE+HOE140致敏組p-P38表達(dá)與空白對(duì)照組相比,表達(dá)略有升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且與相應(yīng)未致敏組相比也未發(fā)現(xiàn)明顯表達(dá)差異(P0.05)。7.2小鼠肝臟ERK MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)水平Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟p-ERK表達(dá)無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE致敏組p-ERK表達(dá)與空白對(duì)照組相比表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h TCE未致敏組相比表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE+HOE140致敏組與72h TCE致敏組相比,p-ERK表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.3小鼠肝臟JNK MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)水平Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟p-JNK表達(dá)無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE致敏組p-JNK表達(dá)與空白對(duì)照組相比表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h TCE未致敏組相比表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE+HOE140致敏組與72h TCE致敏組相比,p-JNK表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.4小鼠肝臟STAT3及其磷酸化蛋白表達(dá)水平Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟p-STAT3表達(dá)無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE致敏組p-STAT3表達(dá)與空白對(duì)照組相比表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h TCE未致敏組相比表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE+HOE140致敏組與72h TCE致敏組相比,p-STAT3表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.各組小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞MAPK通路蛋白表達(dá)情況8.1 Kupffer細(xì)胞P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)水平分離Kupffer細(xì)胞后,提取蛋白,使用Western blot檢測(cè),研究發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟p-P38表達(dá)無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE致敏組p-P38表達(dá)與空白對(duì)照組相比表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h TCE未致敏組相比表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE+HOE140致敏組與72h TCE致敏組相比,p-P38表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.2 Kupffer細(xì)胞ERK MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)水平分離Kupffer細(xì)胞后,提取蛋白,使用Western blot檢測(cè),研究發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟p-ERK表達(dá)無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE致敏組p-ERK表達(dá)與空白對(duì)照組相比表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h TCE未致敏組相比表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE+HOE140致敏組與72h TCE致敏組相比,p-ERK表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.3 Kupffer細(xì)胞JNK MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)水平分離Kupffer細(xì)胞后,提取蛋白,使用Western blot檢測(cè),研究發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟p-JNK表達(dá)無(wú)明顯差異,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE致敏組p-JNK表達(dá)與空白對(duì)照組相比表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h TCE未致敏組相比表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),72h TCE+HOE140致敏組與72h TCE致敏組相比,p-JNK表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.各組小鼠Kupffer細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)水平分離Kupffer細(xì)胞后,提取總RNA,使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Kupffer細(xì)胞炎性因子IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P0.05),72h TCE致敏組Kupffer細(xì)胞IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量明顯上升,與空白對(duì)照組和72h TCE未致敏組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),使用HOE140處理后降低了Kupffer細(xì)胞IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量,TCE+HOE140致敏組與TCE致敏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10.各組小鼠肝臟組織炎性因子表達(dá)水平10.1肝臟中IL-1β表達(dá)水平空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。24h、72h TCE致敏組較空白對(duì)照組相比評(píng)分顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);其中致敏72h組表達(dá)最高,24h、72h TCE致敏組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);然而,72h TCE+HOE140致敏組IL-1β表達(dá)顯著降低,與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h致敏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10.2肝臟中IL-6表達(dá)水平空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。24h、72h TCE致敏組較空白對(duì)照組相比評(píng)分顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);其中致敏72h組表達(dá)最高,24h、72h TCE致敏組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);然而,24h TCE+HOE140致敏組IL-6表達(dá)顯著降低,與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與24h致敏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);72h TCE+HOE140致敏組IL-6表達(dá)顯著降低,與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h致敏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10.3肝臟中TNF-α表達(dá)水平空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。24h、72h TCE致敏組較空白對(duì)照組相比評(píng)分顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);其中72h致敏組表達(dá)最高,24h、72h TCE致敏組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);然而,72h TCE+HOE140致敏組TNF-α表達(dá)顯著降低,與空白對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與72h致敏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.TCE致敏小鼠肝臟組織中BK和B2R表達(dá)明顯升高,并伴有Kupffer細(xì)胞活化;2.HOE140能夠明顯改善TCE致敏小鼠免疫性肝損傷;3.MAPK信號(hào)通路和STAT3蛋白在TCE致敏小鼠肝臟中表達(dá)增強(qiáng),HOE140能夠明顯降低其表達(dá)量;4.Kupffer細(xì)胞MAPK信號(hào)通路及其介導(dǎo)的炎性因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表達(dá)明顯增強(qiáng),HOE140能夠改善其表達(dá)水平;5.BK及其受體B2R介導(dǎo)MAPK調(diào)控Kupffer細(xì)胞炎性因子釋放在TCE致敏小鼠免疫性肝損傷中發(fā)揮重要作用
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文為輔助因子負(fù)責(zé)活化各種組成成分作用，使 KKS 系統(tǒng)的各種成分聚合 已知負(fù)性陰離子表面，如內(nèi)毒素，將無(wú)活性的Ⅻ因子轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘蘑黙，將 PK 裂解為具有酶活性的 KLK[42,43]，活化的 KLK 又可將 HK 裂解成兩部分，一部分為緩激肽（bradykinin, BK），殘留部分可由二硫鍵鏈接形成雙鏈，這種雙鏈的 HK稱為活化型 HK（HKa）[44,45]，具有促進(jìn)炎癥因子釋放和抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能的生物學(xué)活性[46-48] 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn) TCE 致敏小鼠體內(nèi)存在 KKS 系統(tǒng)活化現(xiàn)象[49-51] 因而，我們推測(cè) TCE 致免疫性肝臟損傷中，補(bǔ)體活化同時(shí)或伴有 KKS系統(tǒng)激活的共同參與，且 KKS 系統(tǒng)的激活在 TCE 所致肝臟損傷中可能也起著重要的作用

圖 2 Kupffer 細(xì)胞活化及細(xì)胞因子分泌示意圖Figure 2 Schematic diagram of Kupffer cell activation and cytoksecretion肝臟中，竇狀內(nèi)皮細(xì)胞 星狀細(xì)胞和 Kupffer 細(xì)胞中表達(dá)的 B2R 與K 結(jié)合產(chǎn)生一種門脈性高血壓反應(yīng)，，且 KKS 的調(diào)節(jié)作用在 BK 參病中發(fā)揮著重要的作用[58, 71]，但其在體內(nèi)的分子機(jī)制尚不清楚 BK 與其受體 B2R 結(jié)合均可以激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-a kinases，MAPK)和 STAT3 信號(hào)通路[72,73], 同時(shí)在一些細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)R 的作用通路與 MAPK 途徑有關(guān)[74,75] MAPK 信號(hào)通路是廣泛存在的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由一組級(jí)聯(lián)活化的絲蘇氨酸蛋白激酶組成，的運(yùn)行和基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用，目前在真核細(xì)胞中已確定有 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Regulated c-Jun N-terminal Kinase(JNK) P38 和 ERK5 通路[76] 近年來(lái)，M
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R135.7

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9 Chunfang Tong;Hao Yang;Yu Du;Ning Li;Shouqin L

本文編號(hào)：2615818