發(fā)布時間：2020-04-05 16:39

【摘要】：目的用硅肺患者肺泡巨噬細胞的上清培養(yǎng)液刺激人肺成纖維細胞(MRC-5)建立體外硅肺模型;應用RNA干擾技術沉默MRC-5中IGFBP5基因,免疫細胞化學法和ELISA法檢測MRC-5細胞中I型和III型膠原的表達和含量,探討IGFBP5基因與硅肺纖維化的關系。方法1體外硅肺模型建立:于應急管理部塵肺病康復中心取得II期硅肺患者的支氣管肺泡灌洗液中的肺泡巨噬細胞,體外培養(yǎng)18h后收集用含SiO_2(50μg/ml)的培養(yǎng)液刺激肺泡巨噬細胞所獲得條件培養(yǎng)上清,用條件培養(yǎng)上清與MRC-5共孵育建立體外硅肺模型。2 IGFBP5干擾質粒構建及最佳干擾質粒的選擇:上海吉瑪公司構建IGFBP5干擾質粒及陰性質粒,將干擾質粒及陰性質粒轉染入MRC-5內,48h后采用RT-PCR和Western blot法篩選出干擾效率最高的載體。3實驗分組:分為空白組(C)、SiO_2刺激組(S)、質粒轉染組(T)和陰性質粒轉染組(N)。4 MRC-5中I型和III型膠原蛋白的表達和含量的測定:各組MRC-5培養(yǎng)12小時(半天)、24小時(一天)、36小時(一天半)、48小時(兩天)和60小時(兩天半)后,ICC法和ELISA法檢測兩種膠原蛋白的表達和含量。結果1大容量雙肺灌洗術后灌洗液中獲得含有大量活化的巨噬細胞,經二氧化硅粉塵二次刺激后獲得條件培養(yǎng)上清。2條件培養(yǎng)上清能有效地刺激MRC-5細胞產生I、Ⅲ型。3干擾質粒轉染后激光共聚焦顯微鏡下觀察質粒:脂質體LipofectamineTM2000=2ug:3ul時,細胞轉染效率最高。4通過RT-PCR、Western-blot方法檢測四種質粒轉染后IGFBP5mRNA和蛋白的表達,四種質粒都能不同程度的沉默IGFBP5基因,干擾質粒轉染MRC-5細胞的IGFBP5的mRNA和蛋白的相對表達量較空白組均有降低,四組質粒轉染組蛋白的相對表達量與陰性質粒轉染組相比,與對照組相比,均具有統(tǒng)計學意義,RT-PCR方法(F=156.478,P0.05),Western-blot方法(F=967.144,P0.05),其中質粒A的效果最明顯,降低IGFBP5的蛋白效果最好。5 ICC法和ELISA法檢測MRC-5中的I、III型膠原的表達和含量相同時間點C組MRC-5中的I、III型膠原的表達和含量最低,S組和N組MRC-5中的I、III型膠原的表達和含量最高,S組和N組表達無差別,P0.05。T組MRC-5中的I、III型膠原的表達和含量明顯低于S組和N組,高于C組,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義,P0.05。同一組不同時間點比較MRC-5中的I、III型膠原的表達和含量,12h、24h、36h、48h、60h五個時間點,可見I型膠原的表達和含量36h小時達到峰值,III型膠原的表達和含量48h小時達到峰值。結論1利用RNA干擾技術,將IGFBP5-SiRNA轉染入MRC-5細胞內,可有效抑制IGFBP5基因的表達。2沉默硅肺相關上調基因IGFBP5后,經AM上清刺激的MRC-5細胞內I、III型膠原蛋白表達量減少。圖10幅;表7個;參77篇。
【圖文】：

在全麻狀態(tài)下行大容量雙肺灌洗術，取得灌洗液經過過濾、離心后得到的細胞團細胞主要以激活的巨噬細胞為主，調整細胞濃度細胞總數(shù) 6×108/ml 左右，，經臺盼藍試驗檢驗細胞的存活率；將存活的細胞分別置于無菌培養(yǎng)瓶和六孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 2 小時，倒置顯微鏡下觀察 AM 細胞貼壁成功，帶回中心實驗室繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時。應用 HE 染色觀察巨噬細胞的一般形態(tài)、抗酸染色排除結核桿菌感染巨噬細胞和瑞氏-吉姆薩染色證實為巨噬細胞。HE 染色結果：鏡下可見巨噬細胞體積較大，細胞呈圓形或橢圓形，細胞漿嗜酸性紅染，胞核嗜堿性藍染，居于中央或一側，細胞核腎形，較多細胞胞漿內可見大量遮光性顆粒狀物質，為巨噬細胞吞噬的粉塵顆粒（圖 3 ）�？顾崛旧Y果：抗酸染色主要排除結核桿菌感染，巨噬細胞胞漿呈紫藍色，胞漿內未見染色的結核桿菌（圖 4）。瑞氏-吉姆薩染色結果：常用于血涂片中各種細胞的鑒定，鏡下可見細胞核呈紫紅色，胞漿呈紫藍色，胞漿內可見吞噬顆粒，為巨噬細胞（圖 5）

在全麻狀態(tài)下行大容量雙肺灌洗術，取得灌洗液經過過濾、離心后得到的細胞團細胞主要以激活的巨噬細胞為主，調整細胞濃度細胞總數(shù) 6×108/ml 左右，經臺盼藍試驗檢驗細胞的存活率；將存活的細胞分別置于無菌培養(yǎng)瓶和六孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 2 小時，倒置顯微鏡下觀察 AM 細胞貼壁成功，帶回中心實驗室繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時。應用 HE 染色觀察巨噬細胞的一般形態(tài)、抗酸染色排除結核桿菌感染巨噬細胞和瑞氏-吉姆薩染色證實為巨噬細胞。HE 染色結果：鏡下可見巨噬細胞體積較大，細胞呈圓形或橢圓形，細胞漿嗜酸性紅染，胞核嗜堿性藍染，居于中央或一側，細胞核腎形，較多細胞胞漿內可見大量遮光性顆粒狀物質，為巨噬細胞吞噬的粉塵顆粒（圖 3 ）�？顾崛旧Y果：抗酸染色主要排除結核桿菌感染，巨噬細胞胞漿呈紫藍色，胞漿內未見染色的結核桿菌（圖 4）。瑞氏-吉姆薩染色結果：常用于血涂片中各種細胞的鑒定，鏡下可見細胞核呈紫紅色，胞漿呈紫藍色，胞漿內可見吞噬顆粒，為巨噬細胞（圖 5）
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R135.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 蔣建姝;高路楊;唐軍棟;朱蘭;宋旭東;王獻華;;矽肺患者肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清對人胚肺成纖維細胞增殖的影響[J];中國免疫學雜志;2013年04期

2 趙靜;劉巖;馮麗;王獻華;;經SiO_2活化的硅肺患者肺泡巨噬細胞對肺成纖維細胞的增殖作用[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2011年12期

3 趙靜;吳秀珍;王獻華;;經SiO_2粉塵刺激的矽肺患者肺泡巨噬細胞中CTGF的表達及意義[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2011年11期

4 高衍新;王瑞;;矽塵致肺纖維化機制及細胞因子在矽肺纖維化中的作用[J];中國工業(yè)醫(yī)學雜志;2008年01期

5 郝小惠;張麗;王獻華;;二氧化硅刺激矽肺患者肺泡巨噬細胞介導的人胚肺成纖維細胞增殖及對膠原合成分泌的影響[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志;2007年03期

本文編號：2615256