本文關(guān)鍵詞：siRNA沉默HMGA2對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華北理工大學(xué)》 2015年

siRNA沉默HMGA2對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

劉德方  

【摘要】：目的運(yùn)用RNA干擾技術(shù),在人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)中將肺纖維化相關(guān)基因HMGA2沉默,取矽肺患者肺泡巨噬細(xì)胞的上清培養(yǎng)液刺激MRC-5,觀察MRC-5細(xì)胞中I型和III型膠原的表達(dá)情況,探討HMGA2在矽肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。方法1矽肺患者肺泡巨噬細(xì)胞(AM)的獲取:對(duì)II期矽肺患者進(jìn)行全麻下雙肺灌洗獲取肺泡灌洗液,經(jīng)過(guò)濾、離心、PBS洗滌等過(guò)程,之后做HE、抗酸及瑞氏染色鑒定該細(xì)胞,置于10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)體外培養(yǎng)。2 Si O2刺激肺泡巨噬細(xì)胞(AM)上清液的獲取:在無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM中加入Si O2后繼續(xù)培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞。18h后收集培養(yǎng)上清液,過(guò)濾后冷凍保存。3干擾載體的構(gòu)建:以p GPU6/GFP/Neo-sh GAPDH為載體,經(jīng)上海吉瑪公司構(gòu)建HMGA2干擾載體及其對(duì)照載體。4 HMGA2干擾效率的檢測(cè):干擾載體經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)入人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5內(nèi),轉(zhuǎn)染24h~48h后激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。提取細(xì)胞總m RNA和總蛋白,經(jīng)RT-PCR和Western-blot檢測(cè)出最佳干擾效率的載體用于后續(xù)試驗(yàn)。5實(shí)驗(yàn)分為以下4組:空白對(duì)照組(C),含10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5;刺激組(S),使用經(jīng)Si O2粉塵刺激培養(yǎng)的AM上清液培養(yǎng)MRC-5;轉(zhuǎn)染組(T),將篩選的最佳干擾質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染MRC-5后,再加入經(jīng)Si O2粉塵刺激培養(yǎng)的AM培養(yǎng)上清液培養(yǎng);陰性轉(zhuǎn)染組(N),將陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MRC-5后,再加入經(jīng)Si O2粉塵刺激培養(yǎng)的AM培養(yǎng)上清液培養(yǎng)。6 I型和III型膠原蛋白表達(dá)的檢測(cè):加Si O2刺激AM的培養(yǎng)上清液培養(yǎng)各組人胚肺成纖維細(xì)胞,在培養(yǎng)12h、24h、36h、48h和72h后,免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-blot檢測(cè)其中I、III型膠原蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果1 Lipofectamine TM2000∶脂質(zhì)體質(zhì)粒=2μg∶3μl轉(zhuǎn)染至人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5后24h~48h,激光共聚焦顯微鏡觀察人胚肺成纖維細(xì)胞,結(jié)果顯示90%以上細(xì)胞中有綠色熒光蛋白的表達(dá)。2用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾載體后各組MRC-5細(xì)胞中HMGA2的表達(dá),結(jié)果證實(shí)HMGA2的最佳干擾載體為p GPU6/GFP/Neo-HMGA2-homo-768;陰性轉(zhuǎn)染組(N)與空白對(duì)照組(C)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot法檢測(cè)結(jié)果均顯示:空白對(duì)照組MRC-5細(xì)胞中有I型和III型膠原蛋白的表達(dá);刺激組(S)與空白對(duì)照組(C)細(xì)胞相比,I型和III型膠原蛋白表達(dá)均有上調(diào)(P0.05);轉(zhuǎn)染組(T)與陰性轉(zhuǎn)染組(N)細(xì)胞相比,I型和III型膠原蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.05);陰性轉(zhuǎn)染組(N)與刺激組(S)相比,I型和III型膠原蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異(P0.05),轉(zhuǎn)染組與刺激組相比I型和III型膠原蛋白的表達(dá)也有下調(diào)(P0.05)。結(jié)論1經(jīng)RNA干擾技術(shù)將人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中HMGA2沉默后,其經(jīng)AM上清液刺激而產(chǎn)生的I型和III型膠原蛋白表達(dá)受到明顯抑制。2在人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中下調(diào)HMGA2的表達(dá)可為矽肺的治療提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R135.2
【目錄】：

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【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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