【摘要】：本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、MDC和DAPI染色、熒光蛋白標(biāo)記、RNA干擾、Western Blot分析等細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)和方法,以PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,系統(tǒng)地研究了鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬體形成、自噬流的關(guān)系,并深入解析了Akt-Beclin 1通路在鎘誘導(dǎo)自噬流阻斷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)理。結(jié)果如下:1鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬涉及自噬流阻斷PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞或感染Ad-GFP-LC3的PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞用10和20μM鎘處理8、12、24 h后,經(jīng)MDC染色分析細(xì)胞內(nèi)MDC熒光強(qiáng)度,計(jì)數(shù)GFP-LC3 puncta變化;PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞,在不同濃度鎘(0-20μM)處理8 h或在10μM鎘處理0-24 h后,用Western blot分析LC3-I/II和p62水平變化。結(jié)果顯示,鎘引起PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞中MDC熒光強(qiáng)度增加;鎘處理細(xì)胞中大GFP-LC3 puncta出現(xiàn)并增多;Western blotting顯示鎘以濃度和時(shí)間依賴的方式引起細(xì)胞LC3-II和p62水平升高。提示:鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬涉及自噬流阻斷。2鎘誘導(dǎo)自噬導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡3-MA是一個(gè)常用的自噬體形成抑制劑,我們觀察了3-MA對(duì)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度、GFP-LC3 puncta表現(xiàn)和凋亡的影響;通過(guò)構(gòu)建慢病毒shRNA LC3-I/II下調(diào)PC12細(xì)胞LC3-I/II,觀察鎘誘導(dǎo)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度和凋亡變化。結(jié)果顯示,3-MA抑制鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度以及鎘引起的大GFP-LC3puncta形成,于此同時(shí)3-MA也削弱鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同樣的,下調(diào)LC3-I/II顯著降低鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度和凋亡。提示:鎘誘導(dǎo)自噬導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。3鎘阻斷神經(jīng)細(xì)胞自噬流導(dǎo)致自噬體積累和凋亡使用重組腺病毒表達(dá)mCherry-GFP串聯(lián)雙熒光標(biāo)記LC3(Ad-mCherry-GFP-LC3)感染PC12細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元分析鎘誘導(dǎo)細(xì)胞自噬流表現(xiàn),以及應(yīng)用氯喹(CQ),一個(gè)常用的自噬流抑制劑,進(jìn)一步確認(rèn)自噬流狀態(tài)在鎘誘導(dǎo)自噬致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中作用。結(jié)果顯示,鎘引起mCherry和GFP-LC3共定位的增多,暗示鎘阻斷神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自噬流;通過(guò)CQ抑制自噬流觀察到,CQ進(jìn)一步提高鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度及Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表達(dá)、加重鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明:鎘阻斷神經(jīng)細(xì)胞自噬流導(dǎo)致自噬體積累和凋亡。4鎘通過(guò)激活A(yù)kt-Beclin 1通路誘導(dǎo)自噬涉及自噬流阻斷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡通過(guò)Western Blot觀察暴露于鎘中神經(jīng)細(xì)胞Akt和Beclin 1水平變化;構(gòu)建慢病毒shRNA Beclin 1下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞Beclin1表達(dá),觀察鎘誘導(dǎo)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度及凋亡變化;通過(guò)Akt抑制劑或腺病毒鈍化Akt(Ad-dn-Akt)抑制Akt活性,觀察鎘誘導(dǎo)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度、大GFP-LC3 puncta、自噬流和凋亡表現(xiàn)。結(jié)果顯示,鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞Akt(Ser473)和Beclin 1(Ser295)磷酸化;下調(diào)Beclin 1減弱鎘誘導(dǎo)細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度、Cleaved-caspase-3表達(dá)和凋亡;Akt抑制劑減弱鎘誘導(dǎo)MDC熒光強(qiáng)度增加及保護(hù)抗鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;鈍化Akt(dn-Akt)活性抑制鎘誘導(dǎo)Beclin 1磷酸化、大GFP-LC3 puncta形成和細(xì)胞凋亡;重要的是,鈍化Akt活性部分逆轉(zhuǎn)鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬流阻斷。提示:鎘通過(guò)激活A(yù)kt-Beclin 1通路誘導(dǎo)自噬涉及自噬流阻斷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

正噬[23]

UVRAG 不參與 噬途 中，而是存在于 內(nèi)體（endosome） 構(gòu)上。其早在 2006 年，Liang 等就 先報(bào)道 UVRAG 與 Beclin 1 Vps34 形成復(fù) 體，，促噬體 形成[36]，以 Liang 隨 篇研究也說(shuō)明 UVRAG 促進(jìn)了 噬體 成 與 體 融[37]；這與 Itakura 在 2008 年報(bào)道 UVRAG 不參與 噬不[31]，關(guān)于 UVRAG 爭(zhēng)議，Itakura 為 UVRAG 可能通 Atg9 間 調(diào)控 噬2009 年兩 驗(yàn)室同時(shí)在 Nature Cell Biology 上報(bào)道了 能與 Becl1 Vps34 復(fù) 體 分 —Rubicon （ Run domain protein as Beclininteracting and cystein-rich containing ）[34, 35]； Rubicon Becl1 Vps34-UVRAG 復(fù) 體上，從而 制 噬體與 體 融 ，沉默 Rubicon 進(jìn)了 噬體 成熟。最近，Kim 等報(bào)道 UVRAG 促進(jìn) 噬體與 體 融 ，但是 UVRAG不能促進(jìn) 噬體 生成，mTORC1 能磷酸化 UVRAG Ser498，促進(jìn)了 UVRA與 Rubicon ，從而 噬體與 體 融[38]。 已有研究 ，4 簡(jiǎn)單 表 了 Beclin 1 Vps34 復(fù) 體在 噬中 作用。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2609049