【摘要】：本研究采用細胞培養(yǎng)、MDC和DAPI染色、熒光蛋白標記、RNA干擾、Western Blot分析等細胞和分子生物學技術和方法,以PC12細胞和小鼠原代神經元為實驗對象,系統(tǒng)地研究了鎘誘導細胞凋亡與自噬體形成、自噬流的關系,并深入解析了Akt-Beclin 1通路在鎘誘導自噬流阻斷導致神經細胞凋亡中的作用及其機理。結果如下:1鎘誘導神經細胞自噬涉及自噬流阻斷PC12細胞和小鼠原代神經細胞或感染Ad-GFP-LC3的PC12細胞和小鼠原代神經細胞用10和20μM鎘處理8、12、24 h后,經MDC染色分析細胞內MDC熒光強度,計數GFP-LC3 puncta變化;PC12細胞和小鼠原代神經細胞,在不同濃度鎘(0-20μM)處理8 h或在10μM鎘處理0-24 h后,用Western blot分析LC3-I/II和p62水平變化。結果顯示,鎘引起PC12細胞和小鼠原代神經細胞中MDC熒光強度增加;鎘處理細胞中大GFP-LC3 puncta出現并增多;Western blotting顯示鎘以濃度和時間依賴的方式引起細胞LC3-II和p62水平升高。提示:鎘誘導神經細胞自噬涉及自噬流阻斷。2鎘誘導自噬導致神經細胞凋亡3-MA是一個常用的自噬體形成抑制劑,我們觀察了3-MA對鎘誘導神經細胞MDC熒光強度、GFP-LC3 puncta表現和凋亡的影響;通過構建慢病毒shRNA LC3-I/II下調PC12細胞LC3-I/II,觀察鎘誘導細胞MDC熒光強度和凋亡變化。結果顯示,3-MA抑制鎘誘導神經細胞MDC熒光強度以及鎘引起的大GFP-LC3puncta形成,于此同時3-MA也削弱鎘誘導細胞凋亡。同樣的,下調LC3-I/II顯著降低鎘誘導神經細胞MDC熒光強度和凋亡。提示:鎘誘導自噬導致神經細胞凋亡。3鎘阻斷神經細胞自噬流導致自噬體積累和凋亡使用重組腺病毒表達mCherry-GFP串聯雙熒光標記LC3(Ad-mCherry-GFP-LC3)感染PC12細胞和小鼠原代神經元分析鎘誘導細胞自噬流表現,以及應用氯喹(CQ),一個常用的自噬流抑制劑,進一步確認自噬流狀態(tài)在鎘誘導自噬致神經細胞凋亡中作用。結果顯示,鎘引起mCherry和GFP-LC3共定位的增多,暗示鎘阻斷神經細胞內自噬流;通過CQ抑制自噬流觀察到,CQ進一步提高鎘誘導神經細胞MDC熒光強度及Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表達、加重鎘誘導神經細胞凋亡。這些結果表明:鎘阻斷神經細胞自噬流導致自噬體積累和凋亡。4鎘通過激活Akt-Beclin 1通路誘導自噬涉及自噬流阻斷導致神經細胞凋亡通過Western Blot觀察暴露于鎘中神經細胞Akt和Beclin 1水平變化;構建慢病毒shRNA Beclin 1下調神經細胞Beclin1表達,觀察鎘誘導細胞MDC熒光強度及凋亡變化;通過Akt抑制劑或腺病毒鈍化Akt(Ad-dn-Akt)抑制Akt活性,觀察鎘誘導細胞MDC熒光強度、大GFP-LC3 puncta、自噬流和凋亡表現。結果顯示,鎘誘導神經細胞Akt(Ser473)和Beclin 1(Ser295)磷酸化;下調Beclin 1減弱鎘誘導細胞MDC熒光強度、Cleaved-caspase-3表達和凋亡;Akt抑制劑減弱鎘誘導MDC熒光強度增加及保護抗鎘誘導細胞凋亡;鈍化Akt(dn-Akt)活性抑制鎘誘導Beclin 1磷酸化、大GFP-LC3 puncta形成和細胞凋亡;重要的是,鈍化Akt活性部分逆轉鎘誘導神經細胞自噬流阻斷。提示:鎘通過激活Akt-Beclin 1通路誘導自噬涉及自噬流阻斷導致神經細胞凋亡。
【圖文】：

正噬[23]

UVRAG 不參與 噬途 中，而是存在于 內體（endosome） 構上。其早在 2006 年，Liang 等就 先報道 UVRAG 與 Beclin 1 Vps34 形成復 體，，促噬體 形成[36]，以 Liang 隨 篇研究也說明 UVRAG 促進了 噬體 成 與 體 融[37]；這與 Itakura 在 2008 年報道 UVRAG 不參與 噬不[31]，關于 UVRAG 爭議，Itakura 為 UVRAG 可能通 Atg9 間 調控 噬2009 年兩 驗室同時在 Nature Cell Biology 上報道了 能與 Becl1 Vps34 復 體 分 —Rubicon （ Run domain protein as Beclininteracting and cystein-rich containing ）[34, 35]； Rubicon Becl1 Vps34-UVRAG 復 體上，從而 制 噬體與 體 融 ，沉默 Rubicon 進了 噬體 成熟。最近，Kim 等報道 UVRAG 促進 噬體與 體 融 ，但是 UVRAG不能促進 噬體 生成，mTORC1 能磷酸化 UVRAG Ser498，促進了 UVRA與 Rubicon ，從而 噬體與 體 融[38]。 已有研究 ，4 簡單 表 了 Beclin 1 Vps34 復 體在 噬中 作用。
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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本文編號：2609049