【摘要】：目的:砷是一種廣泛存在于自然界的類金屬元素,長期低濃度砷暴露,會增加包括糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化等慢性病的發(fā)病風險。有研究指出砷暴露可使脂肪細胞脂質分解加劇,進而影響脂質代謝,然而具體機制尚不明確。在脂質代謝調節(jié)中,核轉錄因子NFE2L1起到了重要作用。同時,本研究組已證實,iAs~(3+)可強烈誘導各亞型NFE2L1蛋白表達。基于以上研究結果,本研究將著重探究無機砷暴露對于脂肪細胞脂質分解代謝和NFE2L1表達的影響。隨后,進一步分析NFE2L1調節(jié)脂肪細胞脂質分解代謝機制以及在砷致脂肪細胞脂質分解紊亂中發(fā)揮的作用。研究方法:1.應用C57BL/6雌性小鼠通過飲水進行砷暴露,同時設對照組和砷暴露組,將近乎于病區(qū)真實暴露場景的三價和五價無機砷1:1混合,飲水暴露16周;2.應用NFE2L1脂肪細胞特異性敲除的C57BL/6雄性小鼠,同時設立對照組,正常飲水飲食至16周;3.通過葡萄糖耐量和胰島素耐量實驗檢測小鼠葡萄糖耐受情況和胰島素反應敏感性;4.收取主要組織稱量臟器系數(shù);5.利用病理切片HE染色觀察砷暴露后小鼠脂肪細胞的形態(tài)改變及脂質蓄積情況;6.分離NFE2L1缺失小鼠的白色脂肪組織,提取脂肪原代細胞,給予10μM三價無機砷處理24小時,證實在砷暴露條件下NFE2L1缺失是否影響脂解酶表達;7.利用qRT-PCR技術檢測小鼠NFE2L1和脂質分解相關指標的mRNA表達水平;8.利用Western Blot技術檢測小鼠脂質分解相關指標的蛋白表達;9.利用染色質免疫共沉降實驗分析NFE2L1蛋白與脂解酶啟動子結合情況;10.利用熒光素酶報告基因實驗明確NFE2L1對脂解酶的轉錄調控作用。結果:1.砷暴露影響小鼠糖脂代謝:在其他基礎指標無明顯變化條件下,葡萄糖耐量和胰島素耐量實驗結果顯示,砷處理組小鼠出現(xiàn)明顯的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗;2.砷暴露導致成年雌性小鼠脂肪細胞體積減小并上調脂解酶RNA表達。病理切片HE染色結果提示處理組脂肪細胞體積減小,脂解酶RNA表達水平升高,但蛋白表達變化不明顯;3.Nfe2l1缺失導致成年雄性小鼠脂肪細胞脂解酶表達減少。Nfe2l1缺失后小鼠脂解酶表達在RNA和蛋白水平均降低;4.Nfe2l1在砷引發(fā)小鼠脂肪細胞脂解酶表達增多中起到調節(jié)作用。小鼠脂肪原代細胞經(jīng)砷處理后,Nfe2l1缺失組細胞脂解酶RNA升高水平明顯弱于對照組,對照組砷處理后升高明顯;5.NFE2L1多個亞型在脂解酶啟動子區(qū)域存在結合情況。染色質免疫共沉降結果顯示,NFE2L1-741長亞型和453短亞型蛋白在Lipe2基因啟動子ARE區(qū)域有結合;6.NFE2L1通過與ARE序列結合轉錄調控HSL表達。熒光素酶報告基因實驗結果顯示,NFE2L1-741長亞型對于包含ARE序列的Lipe2啟動子具有明顯的轉錄調控作用。NFE2L1-453短亞型對于包含ARE序列的Lipe2啟動子同樣具有明顯的轉錄調控作用,當ARE序列發(fā)生點突變以及啟動子中不包含ARE序列時,轉錄調控作用明顯減弱。結論:1.體內實驗:無機砷長期暴露可引起體內NFE2L1表達增多,脂解酶表達增多,脂質分解加劇,脂肪細胞儲脂能力減弱,提示該過程可能加劇了糖脂代謝紊亂。2.體外實驗:無機砷暴露條件下,脂肪細胞NFE2L1表達增多,并對脂解酶的表達起到調節(jié)作用。其機制可能為:在砷刺激條件下,NFE2L1活化、入核與sMAFs蛋白和HSL編碼基因Lipe2啟動子ARE結合,上調該基因表達。HSL長期高水平表達,ATGL、MGL和PLIN1等脂解酶也隨之升高,可導致脂肪細胞脂質分解過程的加劇進行。
【圖文】：

成年 C57BL/6雌性小鼠，隨機分為對照組、5 ppm 三價、五價無機砷1:1混合處理組。進行為期16周的飲水砷暴露實驗。在砷暴露期間，進行攝食飲水和體重變化情況監(jiān)測，結果顯示處理組小鼠每日飲水量低于對照（圖3.1A），但兩組小鼠攝食水平、體重變化和臟器系數(shù)無明顯差異。在16周砷暴露后，對兩組小鼠進行葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗。結果顯示，處理組小鼠出現(xiàn)明顯的葡萄糖不耐受（圖3.1 D）和胰島素抵抗（圖3.1 E）。圖3.1 砷暴露影響成年雌性小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性應用12-14周雌性 C57BL/6小鼠，5 ppm 三價、五價無機砷1：1混合飲水，持續(xù)暴露16周，，n = 6-8。A：飲水攝食情況監(jiān)測。*p < 0.05 vs. Veh。B：小鼠體重變化趨勢。C：小鼠臟器系數(shù)。gWAT：性腺旁脂肪，iWAT：皮下脂肪

中國醫(yī)科大學碩士學位論文為驗證 Nfe21l 在小鼠脂肪細胞脂質分解過程中發(fā)揮的作用。我們應用 Nfe2l1 脂肪細胞特異性敲除的 C57BL/6 成年雄性小鼠，分離性腺旁脂肪和皮下脂肪，提取RNA 和蛋白進行指標檢測。RT-PCR 結果表明，Nfe21l(f)-KO 小鼠皮下脂肪脂質分解相關脂解酶基因表達均呈明顯降低，結果具有統(tǒng)計學差異（圖 3.3 C）；性腺旁脂肪脂解酶基因 Lipe2 和 Mgl 呈明顯降低，其他相關基因變化不明顯（圖 3.3 A）。Western Blot 結果顯示，Nfe2l1(f)-KO 小鼠皮下脂肪脂解酶蛋白表達下降趨勢與 RNA趨勢一致（圖 3.3 D）；內臟脂肪脂解酶蛋白表達下降趨勢相對較弱（圖 3.3 B）。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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本文編號：2606954