【摘要】：目的:砷是一種廣泛存在于自然界的類(lèi)金屬元素,長(zhǎng)期低濃度砷暴露,會(huì)增加包括糖尿病、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等慢性病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有研究指出砷暴露可使脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解加劇,進(jìn)而影響脂質(zhì)代謝,然而具體機(jī)制尚不明確。在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中,核轉(zhuǎn)錄因子NFE2L1起到了重要作用。同時(shí),本研究組已證實(shí),iAs~(3+)可強(qiáng)烈誘導(dǎo)各亞型NFE2L1蛋白表達(dá)�；谝陨涎芯拷Y(jié)果,本研究將著重探究無(wú)機(jī)砷暴露對(duì)于脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解代謝和NFE2L1表達(dá)的影響。隨后,進(jìn)一步分析NFE2L1調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解代謝機(jī)制以及在砷致脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解紊亂中發(fā)揮的作用。研究方法:1.應(yīng)用C57BL/6雌性小鼠通過(guò)飲水進(jìn)行砷暴露,同時(shí)設(shè)對(duì)照組和砷暴露組,將近乎于病區(qū)真實(shí)暴露場(chǎng)景的三價(jià)和五價(jià)無(wú)機(jī)砷1:1混合,飲水暴露16周;2.應(yīng)用NFE2L1脂肪細(xì)胞特異性敲除的C57BL/6雄性小鼠,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組,正常飲水飲食至16周;3.通過(guò)葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠葡萄糖耐受情況和胰島素反應(yīng)敏感性;4.收取主要組織稱(chēng)量臟器系數(shù);5.利用病理切片HE染色觀察砷暴露后小鼠脂肪細(xì)胞的形態(tài)改變及脂質(zhì)蓄積情況;6.分離NFE2L1缺失小鼠的白色脂肪組織,提取脂肪原代細(xì)胞,給予10μM三價(jià)無(wú)機(jī)砷處理24小時(shí),證實(shí)在砷暴露條件下NFE2L1缺失是否影響脂解酶表達(dá);7.利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠NFE2L1和脂質(zhì)分解相關(guān)指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平;8.利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)小鼠脂質(zhì)分解相關(guān)指標(biāo)的蛋白表達(dá);9.利用染色質(zhì)免疫共沉降實(shí)驗(yàn)分析NFE2L1蛋白與脂解酶啟動(dòng)子結(jié)合情況;10.利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)明確NFE2L1對(duì)脂解酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。結(jié)果:1.砷暴露影響小鼠糖脂代謝:在其他基礎(chǔ)指標(biāo)無(wú)明顯變化條件下,葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,砷處理組小鼠出現(xiàn)明顯的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗;2.砷暴露導(dǎo)致成年雌性小鼠脂肪細(xì)胞體積減小并上調(diào)脂解酶RNA表達(dá)。病理切片HE染色結(jié)果提示處理組脂肪細(xì)胞體積減小,脂解酶RNA表達(dá)水平升高,但蛋白表達(dá)變化不明顯;3.Nfe2l1缺失導(dǎo)致成年雄性小鼠脂肪細(xì)胞脂解酶表達(dá)減少。Nfe2l1缺失后小鼠脂解酶表達(dá)在RNA和蛋白水平均降低;4.Nfe2l1在砷引發(fā)小鼠脂肪細(xì)胞脂解酶表達(dá)增多中起到調(diào)節(jié)作用。小鼠脂肪原代細(xì)胞經(jīng)砷處理后,Nfe2l1缺失組細(xì)胞脂解酶RNA升高水平明顯弱于對(duì)照組,對(duì)照組砷處理后升高明顯;5.NFE2L1多個(gè)亞型在脂解酶啟動(dòng)子區(qū)域存在結(jié)合情況。染色質(zhì)免疫共沉降結(jié)果顯示,NFE2L1-741長(zhǎng)亞型和453短亞型蛋白在Lipe2基因啟動(dòng)子ARE區(qū)域有結(jié)合;6.NFE2L1通過(guò)與ARE序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控HSL表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,NFE2L1-741長(zhǎng)亞型對(duì)于包含ARE序列的Lipe2啟動(dòng)子具有明顯的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。NFE2L1-453短亞型對(duì)于包含ARE序列的Lipe2啟動(dòng)子同樣具有明顯的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,當(dāng)ARE序列發(fā)生點(diǎn)突變以及啟動(dòng)子中不包含ARE序列時(shí),轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用明顯減弱。結(jié)論:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):無(wú)機(jī)砷長(zhǎng)期暴露可引起體內(nèi)NFE2L1表達(dá)增多,脂解酶表達(dá)增多,脂質(zhì)分解加劇,脂肪細(xì)胞儲(chǔ)脂能力減弱,提示該過(guò)程可能加劇了糖脂代謝紊亂。2.體外實(shí)驗(yàn):無(wú)機(jī)砷暴露條件下,脂肪細(xì)胞NFE2L1表達(dá)增多,并對(duì)脂解酶的表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用。其機(jī)制可能為:在砷刺激條件下,NFE2L1活化、入核與sMAFs蛋白和HSL編碼基因Lipe2啟動(dòng)子ARE結(jié)合,上調(diào)該基因表達(dá)。HSL長(zhǎng)期高水平表達(dá),ATGL、MGL和PLIN1等脂解酶也隨之升高,可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解過(guò)程的加劇進(jìn)行。
【圖文】：

成年 C57BL/6雌性小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、5 ppm 三價(jià)、五價(jià)無(wú)機(jī)砷1:1混合處理組。進(jìn)行為期16周的飲水砷暴露實(shí)驗(yàn)。在砷暴露期間，進(jìn)行攝食飲水和體重變化情況監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示處理組小鼠每日飲水量低于對(duì)照（圖3.1A），但兩組小鼠攝食水平、體重變化和臟器系數(shù)無(wú)明顯差異。在16周砷暴露后，對(duì)兩組小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，處理組小鼠出現(xiàn)明顯的葡萄糖不耐受（圖3.1 D）和胰島素抵抗（圖3.1 E）。圖3.1 砷暴露影響成年雌性小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性應(yīng)用12-14周雌性 C57BL/6小鼠，5 ppm 三價(jià)、五價(jià)無(wú)機(jī)砷1：1混合飲水，持續(xù)暴露16周，，n = 6-8。A：飲水?dāng)z食情況監(jiān)測(cè)。*p < 0.05 vs. Veh。B：小鼠體重變化趨勢(shì)。C：小鼠臟器系數(shù)。gWAT：性腺旁脂肪，iWAT：皮下脂肪

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文為驗(yàn)證 Nfe21l 在小鼠脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解過(guò)程中發(fā)揮的作用。我們應(yīng)用 Nfe2l1 脂肪細(xì)胞特異性敲除的 C57BL/6 成年雄性小鼠，分離性腺旁脂肪和皮下脂肪，提取RNA 和蛋白進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。RT-PCR 結(jié)果表明，Nfe21l(f)-KO 小鼠皮下脂肪脂質(zhì)分解相關(guān)脂解酶基因表達(dá)均呈明顯降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 3.3 C）；性腺旁脂肪脂解酶基因 Lipe2 和 Mgl 呈明顯降低，其他相關(guān)基因變化不明顯（圖 3.3 A）。Western Blot 結(jié)果顯示，Nfe2l1(f)-KO 小鼠皮下脂肪脂解酶蛋白表達(dá)下降趨勢(shì)與 RNA趨勢(shì)一致（圖 3.3 D）；內(nèi)臟脂肪脂解酶蛋白表達(dá)下降趨勢(shì)相對(duì)較弱（圖 3.3 B）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2606954