【摘要】：目的通過體外H9c2心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn),測定不同錳濃度處理組氧化應(yīng)激、線粒體損傷、凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,探討金屬錳染毒對H9c2心肌細(xì)胞的毒性作用。方法(1)采用0,100,200,400μM氯化錳(MnCl_2)分別對大鼠H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行染毒24小時(shí)后,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞存活率。(2)采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒檢測H9c2細(xì)胞凋亡率,Western blot檢測凋亡蛋白Caspase 3、Bcl-2的相對表達(dá)量。(3)采用南京建成試劑盒檢測H9c2心肌細(xì)胞外液心肌酶譜AST和LDH水平。(4)采用南京建成試劑盒檢測H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT水平。采用1mM NAC提前1小時(shí)處理H9c2細(xì)胞后染錳24小時(shí),染錳劑量同上,MTT法檢測細(xì)胞存活率。(5)采用DCFH-DA熒光探針檢測H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平,JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位水平。(6)Western blot檢測不同濃度染錳后,H9c2心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mTOR、p-mTOR、Atg7、p62、Beclin1、Atg5、Atg3、LC3蛋白的相對表達(dá)量。此外,采用50μM的CQ提前2小時(shí)處理H9c2細(xì)胞后染錳24小時(shí),染毒劑量為200μM,Western blot檢測LC3和p62蛋白相對表達(dá)量,共聚焦檢測LC3和p62蛋白免疫熒光。10 nM的Rapamycin提前1小時(shí)處理后,染錳方法同上,Western blot檢測mTOR、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果(1)與對照相比,當(dāng)染錳濃度≥200μM時(shí),隨著染錳濃度的增高,H9c2細(xì)胞存活率顯著下降(P0.05),并可引起H9c2細(xì)胞不同程度的損傷和形態(tài)學(xué)改變。染錳時(shí)間≥12h時(shí),隨著染錳時(shí)間的增加,各組間H9c2細(xì)胞存活率出現(xiàn)顯著性差異(P0.05),細(xì)胞存活率下降。(2)隨著染錳劑量的增加,H9c2心肌細(xì)胞凋亡率增加;各組間凋亡率有顯著差異(P0.05),對照、低、中、高劑量組凋亡率分別為(4.275±2.103%)、(5.225±2.138%)、(10.175±1.756%)、(16.625±5.847%)。各組間Caspase3蛋白相對表達(dá)量無明顯差異,但Cleaved-Caspase 3蛋白相對表達(dá)量顯著增高,400μM劑量組顯著高于其他三組(P0.05),Bcl-2蛋白相對表達(dá)量呈下降趨勢,400μM劑量組顯著低于對照組(P0.05)。(3)隨著染錳劑量的增加,H9c2細(xì)胞外液AST無明顯改變,但LDH水平逐漸升高,對照、低、中、高劑量組LDH水平分別為(378.162±19.243)U/L、(393.297±28.602)U/L、(410.378±29.219)U/L、(432.432±24.526)U/L。200μM劑量組和400μM劑量組顯著高于對照組(P0.05,P0.001)。(4)NAC抗氧化劑+染錳組與僅有染錳組相比,細(xì)胞存活率顯著提高(P0.001);隨著染錳劑量的增加,H9c2細(xì)胞內(nèi)SOD水平呈下降趨勢,染錳組SOD水平均顯著低于對照組(P0.001)。CAT含量也呈下降趨勢,400μM劑量組(2.210±1.601 U/mgprot)顯著低于對照組(4.400±0.790U/mgprot)(P0.05)。(5)隨著染錳劑量的增加,H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高,200μM和400μM劑量組DCFH-DA熒光強(qiáng)度顯著高于對照組(P0.001);H9c2細(xì)胞線粒體膜電位隨著染錳劑量的增加而下降,200μM和400μM劑量組紅色/綠色熒光平均強(qiáng)度與對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。(6)共聚焦結(jié)果顯示,對照組LC3和p62蛋白均彌散分布于胞漿中,染錳組有LC3斑點(diǎn)出現(xiàn)。Western blot結(jié)果顯示,H9c2細(xì)胞400μM劑量組mTOR和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量均顯著低于其余各劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨著染錳劑量的增加,其中Atg7蛋白相對表達(dá)量400μM劑量組顯著低于其余各劑量組(P0.05),Atg5蛋白相對表達(dá)量400μM劑量組顯著低于200μM劑量組(P0.05),Atg3蛋白相對表達(dá)量400μM劑量組顯著低于100μM劑量組(P0.05);LC3I、LC3II蛋白相對表達(dá)量均呈下降趨勢,LC3I蛋白相對表達(dá)量400μM劑量組顯著低于其余各劑量組(P0.05),LC3II蛋白相對表達(dá)量200μM和400μM劑量組顯著低于對照組和100μM劑量組(P0.05)。各組間LC3II/LC3I的比值無顯著性差異(P0.05)。(7)共聚焦結(jié)果顯示,與對照組相比,CQ和CQ+Mn處理組LC3蛋白和p62蛋白熒光強(qiáng)度均增高,胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯聚集成斑點(diǎn)狀的LC3蛋白和p62蛋白,且CQ+Mn組比CQ組更為明顯。Western blot結(jié)果顯示,CQ+Mn處理組p62蛋白相對表達(dá)量顯著升高,與對照組比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CQ和CQ+Mn組LC3II蛋白相對表達(dá)量分別與對照和Mn處理組相比均升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且CQ+Mn處理組LC3II/LC3I比值顯著高于對照與Mn處理組(P0.05),LC3I蛋白相對表達(dá)量在各組間無顯著差異(P0.05)。(8)Rapa處理組和Rapa+Mn處理組mTOR和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量均降低,與對照和Mn處理組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對照和Mn處理組之間,Rapa處理組和Rapa+Mn處理組之間無顯著差別(P0.05)。結(jié)論(1)MnCl_2染毒可導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,升高細(xì)胞凋亡率,降低細(xì)胞存活率。(2)MnCl_2染毒可導(dǎo)致H9c2細(xì)胞LDH水平升高。(3)MnCl_2染毒可引起H9c2細(xì)胞ROS水平升高,線粒體膜電位降低,抗氧化能力下降,氧化應(yīng)激水平增高。(4)MnCl_2染毒可以抑制mTOR信號(hào)通路,啟動(dòng)介導(dǎo)自噬體形成的泛素樣接合系統(tǒng),從而激活自噬。
【圖文】：

圖 3 各 H9c2 心肌 胞形態(tài)學(xué)觀察（10×）Figure 3 Morphological observation of H9c2 cardiomyocytes in each group (10×)[注]：各圖右下角標(biāo)尺為 100 μm。表 2 錳染毒對 H9c2 心肌細(xì)胞凋亡率的影響（ x±SD，%）Table2 The apoptosis rates of different manganese-treated H9c2 cardiomyocytes（ x±SD，%）MnCl2(μM) n 凋亡率 F 值 P 值0 4 4.275 ± 2.103 11.077 0.001100 4 5.225 ± 2.138200 4 10.175 ± 1.756*400 4 16.625 ± 5.847*#@[注]：采用 ANOVA 的 LSD 法進(jìn)行組間兩兩比較。*與對照組比較，P＜0.05；#與 100 μM 劑量組比較，P＜0.05；@與 200 μM 劑量組比較，P＜0.05。

37圖 9 氯化錳對 H9c2 胞 ROS 的影響Figure 9 The ROS levels of different manganese-treated H9c2 cells照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組；E：DCFH-DA 平均熒 的 LSD 法進(jìn)行組間兩兩比較。*與對照組比較，P＜0.05；***與對照組比較，
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2595821