【摘要】：砷污染已經(jīng)成為全世界廣泛關(guān)注的嚴(yán)重環(huán)境問(wèn)題之一，砷中毒造成人體多器官和多系統(tǒng)損害，長(zhǎng)期砷暴露引起皮膚癌、肺癌和肝癌等多種癌癥，但砷化物致癌機(jī)制目前尚不清楚。深入研究砷化物致癌機(jī)制對(duì)于砷中毒的防治具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、壞死具有重要調(diào)控作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的MAPKs信號(hào)通路主要包括3條亞信號(hào)通路：細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶（ERKs）信號(hào)通路，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化；c-Jun N-端激酶（JNKs）信號(hào)通路和p38信號(hào)通路，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡與死亡。 微小RNA（miRNA）與多種腫瘤的發(fā)生存在著密切的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)水平存在顯著差別，從而提示miRNA在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。盡管miRNA的生物學(xué)作用和機(jī)制已逐漸被了解，但是其在環(huán)境致癌物所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和致癌過(guò)程中的作用及其分子機(jī)制尚不清楚。miR-21具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡與遷移的功能，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后有密切關(guān)系。 根據(jù)本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)低水平亞砷酸鈉（NaAsO2）慢性處理所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)miR-21表達(dá)升高等研究結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道MAPKs信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控其下游轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-κB和Ets1等促進(jìn)miR-21轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且miR-21靶蛋白Spry1和Pdcd4可分別負(fù)反饋調(diào)控ERK和JNK信號(hào)通路。因此，我們推測(cè)miR-21與ERK/NF-κB和JNK/c-Jun的兩條反饋環(huán)路參與了低水平NaAsO2所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。 為此，本研究在課題組前期構(gòu)建的低水平NaAsO2慢性處理所致人胚胎肺成纖維（HELF）細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用多種分子生物學(xué)方法探討miR-21與MAPKs信號(hào)通路在低水平NaAsO2所致HELF細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的相互作用及其分子過(guò)程，以揭示低水平砷化物所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的部分分子機(jī)制，從而為進(jìn)一步理解砷化物致癌的分子機(jī)制和尋找砷中毒的生物學(xué)標(biāo)志及防治措施提供一定的科學(xué)依據(jù)。 方法 一、低水平亞砷酸鈉對(duì)HELF細(xì)胞MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路的影響 分別用0.0或1.0μM NaAsO2處理HELF細(xì)胞30代后；或分別用1.0μMNaAsO2處理HELF細(xì)胞0、6或24h。用Western blot檢測(cè)MAPKs相關(guān)信號(hào)分子ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65、p-NF-κB p65、c-Jun、p-c-Jun及PI-3Ks相關(guān)信號(hào)分子Akt、p-Akt的表達(dá)水平，以觀察低水平NaAsO2對(duì)HELF細(xì)胞MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路的影響。 二、低水平亞砷酸鈉對(duì)HELF細(xì)胞miR-21及其靶蛋白水平的影響 分別用0.0或1.0μM NaAsO2慢性處理HELF細(xì)胞30代后；或分別用0.0或1.0μM NaAsO2處理HELF細(xì)胞0、6或24h。用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-21水平；分別用Western blot和RT-PCR檢測(cè)miR-21靶基因Pdcd4和Spry1的蛋白水平和mRNA水平，以觀察低水平NaAsO2對(duì)HELF細(xì)胞miR-21及其靶蛋白水平的影響。 三、MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路在低水平亞砷酸鈉所致HELF細(xì)胞miR-21水平升高及其靶蛋白水平降低中的作用 分別用10.0μM Akt抑制劑LY294002、ERK抑制劑U0126或JNK抑制劑SP600125處理HELF-30T細(xì)胞后，或分別用20nM Con siRNA、NF-κB p65siRNA或c-Jun siRNA處理HELF-30T細(xì)胞后，用Western blot檢測(cè)Akt、ERK、JNK、NF-κBp65和c-Jun水平及其磷酸化程度及Pdcd4、Spry1、cleaved caspase-3和caspase-3水平；用qRT-PCR檢測(cè)miR-21水平；用RT-PCR檢測(cè)Pdcd4和Spry1mRNA水平，以觀察MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路在低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞miR-21水平升高和其靶蛋白Pdcd4和Spry1水平降低及細(xì)胞凋亡中的作用。 四、miR-21在低水平亞砷酸鈉所致HELF細(xì)胞Pdcd4和Spry1蛋白水平降低中的作用 分別用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21轉(zhuǎn)染HELF-30T細(xì)胞24h后，或分別用100nM miR-nc-mimic或miR-21-mimic轉(zhuǎn)染正常HELF細(xì)胞24h后，用qRT-PCR檢測(cè)miR-21水平；分別用Western blot和RT-PCR檢測(cè)Pdcd4和Spry1的蛋白和mRNA水平，以從反向和正向觀察miR-21在低水平NaAsO2所致HELF細(xì)胞靶蛋白Pdcd4和Spry1水平降低中的作用。 五、miR-21通過(guò)Pdcd4和Spry1分別反饋調(diào)控JNK和ERK信號(hào)通路 用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21轉(zhuǎn)染HELF-30T細(xì)胞24h后，或用pIRES-Pdcd4或pIRES-Spry1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HELF-30T細(xì)胞24h后，用Western blot檢測(cè)JNK、c-Jun、ERK和NF-κB蛋白水平及其磷酸化程度、Pdcd4和Spry1蛋白水平，以從反向和正向觀察miR-21在低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞中通過(guò)Pdcd4和Spry1分別反饋調(diào)控JNK和ERK信號(hào)通路。 六、miR-21對(duì)低水平亞砷酸鈉所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞惡性程度、遷移能力及細(xì)胞凋亡的影響 分別用150nM anti-miR-nc或anti-miR-21轉(zhuǎn)染HELF-30T細(xì)胞24h后，用軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞惡性程度；用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；用Westernblot檢測(cè)cleaved caspase-3和caspase-3水平，以觀察下調(diào)miR-21對(duì)低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞的惡性程度、遷移能力及細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果 一、低水平亞砷酸鈉對(duì)HELF細(xì)胞MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0μM NaAsO2慢性處理和急性處理均引起HELF細(xì)胞p-ERK和p-JNK、p-NF-κB p65、p-c-Jun和p-Akt水平明顯升高，而p-p38水平未見(jiàn)明顯改變。說(shuō)明低水平NaAsO2可激活MAPKs信號(hào)通路中的ERK和JNK，而對(duì)p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號(hào)通路中的Akt及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和c-Jun。 二、低水平亞砷酸鈉對(duì)HELF細(xì)胞miR-21及其靶蛋白水平的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0μM NaAsO2慢性和急性處理均引起HELF細(xì)胞miR-21水平明顯升高，而其靶蛋白Pdcd4和Spry1蛋白水平明顯降低，但Pdcd4和Spry1mRNA水平未見(jiàn)明顯改變。說(shuō)明低水平NaAsO2引起HELF細(xì)胞miR-21水平升高和Pdcd4及Spry1蛋白水平降低。 三、MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路在低水平亞砷酸鈉所致HELF細(xì)胞miR-21水平升高及其靶蛋白水平降低中的作用 結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125均能引起HELF-30T細(xì)胞miR-21水平明顯降低，而Spry1和Pdcd4蛋白水平明顯升高，并使cleavedcaspase-3水平升高而caspase-3水平降低，而Spry1和Pdcd4的mRNA水平未發(fā)生明顯改變；而Akt抑制劑LY294002處理后對(duì)上述指標(biāo)均無(wú)明顯改變。關(guān)閉NF-κB p65和c-Jun均明顯引起HELF-30T細(xì)胞miR-21水平明顯降低，，而Spry1和Pdcd4蛋白水平明顯增加，cleaved caspase-3水平升高和caspase-3水平降低，但Spry1和Pdcd4mRNA水平未見(jiàn)明顯變化。說(shuō)明ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號(hào)通路而非PI-3Ks信號(hào)通路參與了低水平NaAsO2慢性處理所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞miR-21水平升高，Spry1和Pdcd4蛋白水平降低及細(xì)胞凋亡。 四、miR-21在低水平亞砷酸鈉所致HELF細(xì)胞Pdcd4和Spry1蛋白水平降低中的作用 結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染anti-miR-21的HELF-30T細(xì)胞miR-21水平明顯降低，且Pdcd4和Spry1蛋白水平均顯著高于未轉(zhuǎn)染HELF-30T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miR-21-mimic的正常HELF細(xì)胞miR-21水平也明顯升高，而其Pdcd4和Spry1蛋白水平均顯著降低，但是Pdcd4和Spry1mRNA水平均未發(fā)生明顯改變。說(shuō)明在低水平NaAsO2所致HELF細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中miR-21通過(guò)調(diào)控Pdcd4和Spry1蛋白水平發(fā)揮作用。 五、miR-21通過(guò)Pdcd4和Spry1分別反饋調(diào)控JNK和ERK信號(hào)通路 結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)anti-miR-21下調(diào)miR-21水平后，HELF-30T細(xì)胞Pdcd4和Spry1蛋白水平升高，而p-JNK和p-ERK水平降低；轉(zhuǎn)染pIRES-Pdcd4重組質(zhì)粒上調(diào)Pdcd4水平后，HELF-30T細(xì)胞p-JNK和p-c-Jun水平明顯降低；轉(zhuǎn)染pIRES-Spry1重組質(zhì)粒上調(diào)Spry1水平后，HELF-30T細(xì)胞p-ERK和p-NF-κB p65水平明顯降低。說(shuō)明miR-21在低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞中通過(guò)靶蛋白Pdcd4和Spry1分別反饋調(diào)控JNK/c-Jun和ERK/NF-κB信號(hào)通路。 六、miR-21對(duì)低水平亞砷酸鈉所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞惡性程度、遷移能力及細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染anti-miR-21下調(diào)miR-21的HELF-30T細(xì)胞在軟瓊脂上形成的集落數(shù)明顯低于對(duì)照HELF-30T細(xì)胞，且集落大小也明顯變小，其劃痕愈合率也明顯低于對(duì)照HELF-30T細(xì)胞，而cleaved caspase-3水平升高和caspase-3水平降低。說(shuō)明下調(diào)miR-21可明顯降低低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞的惡性程度、遷移能力和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論 1、低水平NaAsO2可激活HELF細(xì)胞MAPKs信號(hào)通路中的ERK和JNK，而對(duì)p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號(hào)通路中的Akt及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和c-Jun。 2、低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞中miR-21水平升高而Pdcd4和Spry1蛋白水平降低。 3、ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號(hào)通路而非PI-3Ks信號(hào)通路參與了低水平NaAsO2慢性處理所致HELF細(xì)胞miR-21水平升高和Spry1和Pdcd4蛋白水平降低及細(xì)胞凋亡。 4、miR-21在低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞中可通過(guò)靶蛋白Pdcd4和Spry1分別反饋調(diào)控JNK和ERK信號(hào)通路。 5、miR-21促進(jìn)低水平NaAsO2所致惡性轉(zhuǎn)化HELF細(xì)胞的惡性程度和遷移能力及抑制細(xì)胞凋亡。 總之，本研究結(jié)果提示低水平NaAsO2激活ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號(hào)通路，引起miR-21水平升高而抑制靶蛋白Spry1和Pdcd4表達(dá)水平，從而引起HELF細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞凋亡減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且miR-21又可通過(guò)Spry1和Pdcd4分別反饋調(diào)控ERK/NF-κB和JNK/c-Jun信號(hào)通路。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-21與MAPKs信號(hào)通路反饋調(diào)控在NaAsO2所致HELF細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

慢性處理可激活MAPKs信號(hào)通路中的ERK和JNK，而對(duì)p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號(hào)通路中的Akt及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和c-Jun。圖1. 低水平NaAsO2慢性處理對(duì)HELF細(xì)胞MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路的影響A和B：Western blot圖；C：相對(duì)蛋白水平。與同代對(duì)照相比：**P<0.01

信號(hào)通路中的ERK和JNK，而對(duì)p38影響不大，并可激活PI-3Ks信號(hào)通路中的Akt及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和c-Jun。圖2. 低水平NaAsO2急性處理對(duì)HELF細(xì)胞MAPKs和PI-3Ks信號(hào)通路的影響A和B：Western blot圖；C：相對(duì)蛋白水平。與對(duì)照相比：**P<0.01
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 方國(guó)強(qiáng);吳炳禮;李恩民;許麗艷;;miR-21與腫瘤[J];癌變.畸變.突變;2010年01期

2 蔣義國(guó);楊巧媛;;環(huán)境化學(xué)致癌研究若干熱點(diǎn)與問(wèn)題[J];環(huán)境與健康雜志;2010年05期

3 楊陽(yáng);甘福生;汪泱;;miRNA與阿爾茲海默氏病[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2010年02期

4 李繼霞,周克元;miRNA的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2003年05期

5 張韻;歐兵;吳君;;砷致肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及凋亡[J];世界華人消化雜志;2007年21期

6 劉利英;徐紀(jì)茹;宋土生;黃辰;;miRNA及其靶位點(diǎn)多態(tài)性的研究進(jìn)展[J];遺傳;2010年11期

本文編號(hào)：2586586