【摘要】：腸道菌群在維持機(jī)體的健康過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,與人體的消化營(yíng)養(yǎng)、免疫代謝、生物拮抗等密切相關(guān)。但是近年來(lái),抗生素的過(guò)度使用導(dǎo)致了腸道菌群的紊亂,對(duì)機(jī)體的健康產(chǎn)生了較大的影響,而如何改善由抗生素引起的腸道菌群紊亂成為了研究熱點(diǎn)。乳酸菌是人體腸道中重要的有益菌,可以通過(guò)抑制致病菌的繁殖來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂,達(dá)到改善腸道微環(huán)境的效果。本文利用分離篩選出的具有益生功能的乳酸菌,研究其混合發(fā)酵乳在體外抑制腸道致病菌的能力,通過(guò)Illumina高通量測(cè)序技術(shù)探討混合乳酸菌發(fā)酵乳對(duì)抗生素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)作用。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)從廣西巴馬長(zhǎng)壽人群糞便和云南新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離乳酸菌,并研究其耐酸耐膽鹽能力、黏附細(xì)胞能力、抑菌能力及耐藥特性。結(jié)果表明,45株乳酸菌中,菌株J、La、Xn及Yd 4株乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力較高,在pH為3.0的人工模擬胃液中培養(yǎng)3h存活率分別為43.38%、65.89%、20.32%、57.75%,在膽鹽濃度為0.30%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的存活率分別為45.96%、53.33%、22.33%、31.05%;4株乳酸菌對(duì)細(xì)胞IEC-6的黏附率均大于8個(gè)/cell;對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌及艱難梭菌3種腸道病原菌的抑制能力均為高度抑菌,抑菌圈直徑均大于20mm;經(jīng)生理生化及16SrRNA鑒定,菌株Xn為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacilusfermentum),菌株 La、Yd 均為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),菌株J 為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)。(2)研究乳酸菌單菌株及其混合菌株的發(fā)酵特性,通過(guò)對(duì)單菌株和混合菌株的發(fā)酵上清液分別作去酸、去蛋白及去過(guò)氧化氫處理來(lái)測(cè)定其抑制腸道病原菌的能力,并利用響應(yīng)面優(yōu)化混合乳酸菌發(fā)酵乳的制備條件。結(jié)果表明,混合乳酸菌在發(fā)酵10h后的酸度為120.07°T,高于單菌株發(fā)酵;去酸后的4株菌株發(fā)酵上清液對(duì)3種病原菌均沒(méi)有抑制作用;發(fā)酵上清液去除蛋白后,菌株L.plantarum La對(duì)大腸桿菌抑制作用有影響而對(duì)沙門氏菌抑制作用影響不顯著(P0.05),菌株L.rhamnosusJ對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用并無(wú)影響(P0.05),菌株L.fermentum Xn對(duì)艱難梭菌抑制作用顯著(P0.05),菌株L.rhamnosums J、L.plantarum Yd、L.plantaarum La對(duì)艱難梭菌的抑菌作用有所下降但并不顯著(P0.05);發(fā)酵上清液排除過(guò)氧化氫后,4株菌均對(duì)大腸桿菌的抑制作用發(fā)生顯著變化(P0.05),菌株L.fermentum Xn、L.plantarum Yd對(duì)沙門氏菌和艱難梭菌抑制作用影響顯著(P0.05),菌株L.plantarum La對(duì)沙門氏菌影響顯著(P0.05)而對(duì)艱難梭菌影響不顯著(P0.05),菌株L.rhamnosus J對(duì)沙門氏菌和艱難梭菌的抑菌作用影響均不顯著(P0.05)。乳酸菌混合發(fā)酵后,對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為30.81mm,對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑為26.22mm,對(duì)艱難梭菌的抑菌圈直徑為23.53mm�；旌先樗峋l(fā)酵乳制備的最佳條件是:糖添加量為6.06%,接種量為3.88%,發(fā)酵溫度為39℃,此模型下發(fā)酵乳活菌數(shù)為9.501g(CFU/mL),實(shí)際測(cè)得為9.441g(CFU/mL),對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為31.75±0.42mm,沙門氏菌的抑菌圈直徑為26.34±0.69mm,艱難梭菌的抑菌圈直徑為24.51±0.52mm,均高于單菌株發(fā)酵。(3)通過(guò)鹽酸林可霉素建立小鼠腸道菌群失衡模型,利用混合乳酸菌及其發(fā)酵乳進(jìn)行干預(yù),測(cè)定小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌與腸桿菌的比值(B/E)及其體重、日攝食量、血清內(nèi)毒素含量、脾指數(shù)、血清球蛋白含量與免疫球蛋白(IgG)含量。結(jié)果表明,鹽酸林可霉素干預(yù)3d(60mg/次,2次/d),小鼠腸道的雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量分別為7.541gCFU·g-1、5.861gCFU·g-1,均顯著低于對(duì)照組(P0.05),而腸球菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P0.05)。同時(shí),模型組小鼠腸道的B/E值顯著低于對(duì)照組(P0.05),且在7d內(nèi)未得到恢復(fù)。抗生素降低了小鼠腸絨毛黏膜完整性,腸腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的細(xì)胞團(tuán)塊,菌懸液干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜較完整,發(fā)酵乳干預(yù)組小鼠結(jié)腸組織表面光滑,黏膜肌層恢復(fù)較好,菌懸液預(yù)防組小鼠腸絨毛輕微變短、輪廓不清,腸黏膜組織少量空泡變性,發(fā)酵乳預(yù)防組小鼠結(jié)腸黏膜較完整,腸絨毛輪廓較清晰,少量空泡變性�；旌先樗峋深A(yù)7d后,菌懸液及其發(fā)酵乳組小鼠的體重增加幅度高于對(duì)照組,日攝食量也高于模型組;菌懸液干預(yù)組、發(fā)酵乳干預(yù)組、菌懸液預(yù)防組及發(fā)酵乳預(yù)防組小鼠的血清內(nèi)毒素含量均顯著低于模型組(P0.05),分別為0.3725 EU·L-1、0.3631 EU·L-1、0.3758 EU·L-1 0.3831 EU·L-1;菌懸液干預(yù)組及其發(fā)酵乳干預(yù)組小鼠的脾指數(shù)分別為2.48mg·g-1、2.45mg·g-1,而菌懸液預(yù)防組及發(fā)酵乳預(yù)防組分別為2.37mg·g-1、2.16mg·g-1,均顯著高于模型組(P0.05);模型組小鼠的血清球蛋白和IgG含量分別為19.82 g·L-1、0.78 g·L-1,而菌懸液干預(yù)組、發(fā)酵乳干預(yù)組、菌懸液預(yù)防組及發(fā)酵乳預(yù)防組的小鼠血清球蛋白含量分別為 25.75 g·L-1、27.54 g·L-1、22.47 g·L-1、24.06 g·L-1,IgG 含量分別為 0.92 g·L-1、0.98 g·L-1、0.85 g·L-1、0.91 g·L-1,與模型組相比,均顯著升高(P0.05)。(4)利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)研究混合乳酸菌發(fā)酵乳對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用,并對(duì)小鼠結(jié)腸組織HE染色后觀察。小鼠腸道菌群組成在門的水平上,主要為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門;空白對(duì)照組小鼠腸道中厚壁菌門含量為32.68%,抗生素降低了小鼠腸道中厚壁菌門的含量,為3.87%,菌懸液預(yù)防組及發(fā)酵乳預(yù)防組小鼠腸道中厚壁菌門含量分別為30.44%、33.90%,混合乳酸菌及其發(fā)酵乳干預(yù)后,厚壁菌門含量恢復(fù)至對(duì)照組的水平,分別為35.30%、32.39%;空白對(duì)照組小鼠腸道中擬桿菌門含量為53.58%,抗生素的干預(yù)增加了擬桿菌門的含量,為54.44%,菌懸液預(yù)防組及發(fā)酵乳預(yù)防組小鼠腸道中擬桿菌門含量分別為51.05%、49.15%,混合乳酸菌及其發(fā)酵乳的干預(yù)降低了擬桿菌門的含量,分別為50.37%、51.33%;空白對(duì)照組小鼠腸道中變形菌門的含量為7.24%,抗生素的干預(yù)增加了變形菌門的含量,為36.58%,菌懸液預(yù)防組及發(fā)酵乳預(yù)防組小鼠腸道中變形菌門含量分別為12.47%、12.73%,混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳干預(yù)組小鼠腸道中變形菌門含量分別為7.76%、10.29%。模型組小鼠腸道在屬水平上菌群主要包含·Parabacteroides spp.、Clostridium spp.及Escherichia spp.等多個(gè)屬,在空白對(duì)照組與4組試驗(yàn)組中,菌群包含Bacteroides spp.、Lachnospira spp.、Ruminococcus spp.及未分類_S24-7屬,這4個(gè)屬的菌群分別占各組中菌群總量的 80.94%、76.62%、78.92%、69.51%、67.11%。Klebsiella spp.致病性較強(qiáng),Klebsiella spp.在空白組中含量為0.0012%,抗生素干預(yù)后,Klebsiella spp.含量升高,為1.03%,而在其余4組中未檢出;Salmonella spp.對(duì)動(dòng)物致病性強(qiáng),抗生素干預(yù)后,Salmonella spp.含量達(dá)到1.05%,在其余5組中未檢出;Clostridium spp.主要是一類專性厭氧、革蘭陽(yáng)性的梭狀桿菌,空白組中的含量為0.14%,抗生素干預(yù)后,Clostridium spp.在模型組中的含量升高,為20.01%,Clostridium spp.在菌懸液預(yù)防組和發(fā)酵乳預(yù)防組中的含量分別為0.08%、0.33%,混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳干預(yù)降低Clostridium spp.含量,為0.02%、0.10%。此外,Blautia spp.可將腸道中氣體轉(zhuǎn)化成乙酸,使氣體得以清除,并且能夠在腸道內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸,空白對(duì)照組中Blautia spp.的含量為0.178%,抗生素干預(yù)后,模型組中Blautia spp.的含量幾乎為0,Blautia spp.在菌懸液預(yù)防組和發(fā)酵乳預(yù)防組中的含量分別為0.093%、0.106%,混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳干預(yù)增加了Blautia spp.的含量,分別為0.087%、0.163%;Lactobacillus spp.在這5組糞便樣品菌群總量中的所占比例分別為0.93%、0.26%、0.57%、0.30%和0.86%,而在模型組中未檢出。
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ邋ａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ邋ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ邋ｏｆ邋ＬＡＢ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｔｈｅ邋ｒｅｍｏｖａｌ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｐｅｒｏｘｉｄｅ邋ｏｒ邋ａｃｉｄ邋ａｇａｉｎｓｔ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ邋ｂａｃｔｅｒｉａ逡逑由圖３－２可知，發(fā)酵上清液去除蛋白后，菌株如ｒｗｍ邋Ｌａ對(duì)大腸桿菌抑制作用有逡逑影響而對(duì)沙門氏菌抑制作用影響不顯著（Ｐ＞０．０５），，菌株Ｌ．邋ｒＡａ／ＴｍｏｍｙＪ對(duì)大腸桿菌和沙逡逑門氏菌的抑制作用并無(wú)影響（Ｐ＞０．０５），菌株娭ｍ邋Ｘｎ對(duì)艱難梭菌抑制作用顯逡逑

揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文．０５），菌株ｒ／＾／Ｔｍｏｍｓ１邋Ｊ、Ｌ．夕／ｆｌ扣ａｒｗｍ邋Ｙｄ、Ｌ．戶／ａｗ如＊ｗｍ邋Ｌａ對(duì)艱難梭菌的抑菌下降但并不顯著（Ｐ＞0．0５）。發(fā)酵上清液排除過(guò)氧化氫后，４株菌均對(duì)大腸桿菌用發(fā)生顯著變化（Ｐ＜０．０５），菌株對(duì)沙門氏菌菌抑制作用影響顯著（戶＜0．０５），菌株Ｚ．邋ｐ／⑴Ｌａ對(duì)沙門氏菌影響顯著（尸＜０．０５難梭菌影響不顯著（Ｐ＞0．0５），菌株對(duì)沙門氏菌和艱難梭菌的抑菌逡逑響均不顯著（Ｐ＞0．0５）。去酸后的４株菌株發(fā)酵上清液對(duì)３種病原菌均沒(méi)有抑制此可以推斷，單菌株發(fā)酵發(fā)揮抑菌作用的主要因素是乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酸。逡逑合乳酸菌發(fā)酵對(duì)腸道病原菌的抑制作用逡逑圖３－２可知，菌株Ｊ發(fā)酵上清液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的艱難梭菌抑制效果較好Ｘｎ、Ｌ．邐Ｙｄ、Ｌ．邋／？／ａ咐ａｒｗｗ邋Ｌａ發(fā)酵上清液對(duì)革蘭氏陰性大沙門氏菌的抑制效果較好。因此，進(jìn)一步對(duì)比這４株單菌株發(fā)酵上清液以及混合液對(duì)病原菌的抑制效果。結(jié)果如下圖３－３、３－４所示。逡逑＿
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R151;TS201.3

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本文編號(hào)：2583854