【摘要】：【目的】探討、優(yōu)化基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測常規(guī)食品中感染性痢疾志賀氏菌的方法�！痉椒ā吭贜CBI數(shù)據(jù)庫中搜索獲取志賀氏菌的特異性基因高度保守區(qū),設(shè)計(jì)3對LAMP反應(yīng)引物,建立、優(yōu)化該LAMP可視化檢測方法,并評價(jià)其特異性、靈敏度,同時(shí)與PCR檢測方法和傳統(tǒng)檢測方法對比,進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析�！窘Y(jié)果】5株志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品均檢測為陽性,11株非志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品均檢測為陰性,無交叉反應(yīng)。最低檢驗(yàn)限為1.6×101 CFU/反應(yīng)(或1.6×101 CFU/m L),且經(jīng)比較,LAMP檢測靈敏度比PCR檢測高出1個(gè)數(shù)量級。通過對161份實(shí)際樣品和人工污染樣品進(jìn)行檢測,LAMP檢測與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果具有較高的一致性�！窘Y(jié)論】LAMP具有檢測過程快速簡便、檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn),適用于對常規(guī)食品中感染性痢疾志賀氏菌的高效、快速檢測需求。
【圖文】：

NTPs(10mmol/L)2μL、3對引物混合物(FIP/BIP1.6μmol/L，F(xiàn)L/BL0.8μmol/L，F(xiàn)3/B30.2μmol/L)2μL、DNA模板2.5μL、顯色液2.5μL、超純水2.5mL。充分混勻后置于水浴鍋中61°C反應(yīng)50min，最后經(jīng)肉眼觀察，根據(jù)檢測管中顯色試劑的顏色變化判讀檢測結(jié)果，具體為陽性顯示綠色，陰性顯示淺橙紅色(未變色)，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察各個(gè)樣品反應(yīng)情況，陽性樣品檢測管呈明顯熒光綠，條帶清晰，陰性樣品檢測管未見顏色變化，未見明顯條帶，見圖1、2。另外，PCR反應(yīng)體系為：10×PCRbuffer2.5μL，TaqDNApolymerase(5U/μL)圖1LAMP快速檢測顯色圖Figure1ResultsofchangeincolorofLAMP-baseddetectionmethod注：M：MarkerDL2000；1：非志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品；25：志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品.Note:M:MarkerDL2000;1:Non-Shigellastandardsample;25:Shigellastandardstrainsamples.

周楊等:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品中痢疾志賀氏菌快速檢測2251Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn圖2LAMP快速檢測電泳圖Figure2ElectrophoreticresultsofLAMPproductofchangeincolor注：M：MarkerDL2000；1：非志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品；25：志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品.Note:M:MarkerDL2000;1:Non-Shigellastandardsample;25:Shigellastandardstrainsamples.1μL，dNTPs(10mmol/L)0.5μL，引物混合物(PF/PR0.5μmol/L)2.5μL，DNA模板2.5μL，超純水16μL。PCR反應(yīng)條件為：94°C5min；94°C30s，57°C30s，72°C30s，35個(gè)循環(huán)；72°C5min，其結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察。2.2特異性試驗(yàn)5株志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品均顯示明顯熒光綠色，，即為檢測陽性；而11株非志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品仍為反應(yīng)前的淺橘紅色，即為檢測陰性，且以上平行測試結(jié)果一致，見表2。2.3靈敏度試驗(yàn)當(dāng)稀釋倍數(shù)在100106倍時(shí)，對應(yīng)的檢測管均顯示明顯熒光綠色，即為檢測陽性；而稀釋倍數(shù)在107108時(shí)，對應(yīng)的檢測管仍為反應(yīng)前的淺橘紅色，即為檢測陰性，見圖3，以上平行測試結(jié)果一致。并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測以上不同濃度樣品對應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，顯示出明顯的梯狀條帶，見圖4。而PCR檢測結(jié)果顯示，只有在稀釋倍數(shù)在100105倍時(shí)，出現(xiàn)較明顯的產(chǎn)物條帶，見圖5。經(jīng)比較LAMP檢測靈敏度比PCR檢測高出1個(gè)數(shù)量級，LAMP檢驗(yàn)限達(dá)到1.6×101CFU/mL。表2特異性檢測結(jié)果Table2Resultsofspecificity菌株名稱Strainname菌株編號(hào)Strainnumber檢測結(jié)果DetectionresultS.dysenteriaeCMCC(B)51105+S.flexneriCMCC(B)51572+S.sonneiCMCC(B)51592+S.flexneriATCC12022+S.boydiiATCC9207+V.parahaemol

【相似文獻(xiàn)】

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1 王文娟;趙宏坤;;大腸埃希O157:H7等致病菌多重PCR法快速檢測試劑盒的研制[J];中國食品學(xué)報(bào);2011年03期

本文編號(hào)：2580115