【摘要】：背景： 隨著轉(zhuǎn)基因食品大量涌入中國市場，食物潛在的致敏性等安全問題越來越受到人們的關(guān)注。建立科學(xué)有效的食物過敏原性評價及檢測方法成為科學(xué)家們研究的熱點，而尋找一種低過敏原性的參照標(biāo)準(zhǔn)品是建立過敏原性評價及檢測方法的關(guān)鍵問題之一。大米蛋白營養(yǎng)價值高，消費廣泛，其過敏原性在所有谷物中是最低的，而且在中國，人們普遍食用大米，極少發(fā)生過敏現(xiàn)象，具有成為轉(zhuǎn)基因食品過敏原性評價參照標(biāo)準(zhǔn)品的潛能。RA17（Rice allergen17）是大米主要過敏原之一，也是禾本科家族成員之間的交叉變應(yīng)原的代表，因此，RA17是進行大米過敏原性評價的最佳參考品。 目的： 通過基因工程技術(shù)原核表達大米主要過敏原RA17蛋白，為大米過敏原性的評價、單克隆抗體的制備以及轉(zhuǎn)基因食品過敏原性評價參照標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建等后續(xù)研究提供實驗材料。 方法： 1、人工手動對RA17基因序列進行密碼子優(yōu)化，并將優(yōu)化的RA17基因由上海博尚生物技術(shù)有限公司進行全序列合成。 2、將RA17基因與含有strepⅡ標(biāo)簽的表達載體pET-44a連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中進行重組表達，，并對其表達條件進行優(yōu)化。 3、采用超聲破碎法裂解菌體，獲得包涵體，通過StrepTrapHP柱親和層析純化目的蛋白，并采用BCA蛋白定量和SDS-PAGE電泳技術(shù)對RA17重組蛋白的濃度和純度進行分析。 4、采用蛋白免疫印跡技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法對RA17重組蛋白進行鑒定。 結(jié)果： 1、獲得密碼子優(yōu)化的RA17基因序列并成功構(gòu)建了表達載體pET-44a-RA17。 2、實驗條件綜合分析得出RA17重組表達菌株在30oC，IPTG誘導(dǎo)劑終濃度1.0mmol/L，持續(xù)表達3h，蛋白的表達量最高。 3、獲得分子量大小約為16kDa，純度達95%以上的RA17重組蛋白。 結(jié)論： 本研究首次在國內(nèi)成功重組表達了分子量大小約為16kDa的大米主要過敏原RA17蛋白，為大米主要過敏原的過敏原性評價、單克隆抗體的制備以及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因食品過敏原性評價參照標(biāo)準(zhǔn)品等后續(xù)研究提供了實驗材料。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：S511;R151

【參考文獻】

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本文編號：2554257