【摘要】：背景： 三聚氰胺，又稱為蛋白精，是一種有機(jī)化合物，在許多制品中被廣泛用作有機(jī)化學(xué)中間體。目前，它最重要的作用是作為三聚氰胺樹脂的原材料。另外，三聚氰胺在建筑材料、滅火劑、紡織業(yè)、皮革制品、造紙業(yè)及其它工業(yè)中也被使用。此外，它還可以用來合成藥物或作為其載體分子。 三聚氰胺有一定的毒性，本不應(yīng)該在食品中出現(xiàn)，但卻相繼出現(xiàn)了幾起三聚氰胺食品污染事件。例如，2007年在美國發(fā)生的寵物食品污染；2008年中國的毒奶粉事件導(dǎo)致29萬兒童患病，其中6人因?yàn)槟虻篮湍I臟的并發(fā)癥而死亡，這是一起非常嚴(yán)重的中毒事件，引起了全世界的關(guān)注。此次認(rèn)為嬰兒的腎臟衰竭是由食物中的三聚氰胺及其衍生物所致。但是目前對這種化合物單獨(dú)或協(xié)同作用還不是完全清楚。而當(dāng)國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了當(dāng)時對中國市場乳制品檢測結(jié)果時，更造成了人們對乳產(chǎn)品的恐慌，對中國乳制品產(chǎn)業(yè)造成了重創(chuàng)。美國FDA在發(fā)表有關(guān)三聚氰胺限量值的報告時同時指出，“根據(jù)目前的研究，還無法對嬰兒奶粉建立一個他們認(rèn)為不會引起健康顧慮的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)，我們對三聚氰胺了解得太少了”�？梢娍茖W(xué)深入地理解三聚氰胺的生物學(xué)和毒理學(xué)效應(yīng),不僅是研究需要,更是社會穩(wěn)定的必要。然而目前并沒有詳細(xì)的或非常系統(tǒng)的報告，因?yàn)楝F(xiàn)已發(fā)表的關(guān)于三聚氰胺的文獻(xiàn)跨越了不同的研究目的。 目的： 雖然人們對三聚氰胺的性質(zhì)了解很多，但是仍然還存在一些盲點(diǎn)：三聚氰胺導(dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制并沒有完全研究清楚；三聚氰胺及其同系物的協(xié)同效應(yīng)也沒有充分的解釋。因此，本研究旨在確定三聚氰胺和它的同系物（三聚氰酸）在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的毒性作用及細(xì)胞水平的半數(shù)致死量。然后根據(jù)體外的研究，觀察在wistar大鼠各個器官中這兩種物質(zhì)單獨(dú)及協(xié)同作用的毒性，確定這些物質(zhì)除了對腎臟及泌尿系統(tǒng)相關(guān)的器官產(chǎn)生毒性外，還對其他組織產(chǎn)生的影響。 方法： 本研究首先使用MTT比色，在體外培養(yǎng)的NRK-52E和293T細(xì)胞系中加入不同濃度的三聚氰胺或三聚氰酸，檢測細(xì)胞細(xì)胞增殖活性，計(jì)算三聚氰胺和三聚氰酸對這兩種細(xì)胞的半數(shù)致死量。隨后根據(jù)三聚氰胺和三聚氰酸的細(xì)胞毒性進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物采1月齡wistar大鼠，隨機(jī)分為四組，每組四只（雌雄各半），對各組動物進(jìn)行4周灌胃處理，每日1次。第1組：3mL生理鹽水灌胃；第2組：3mL三聚氰胺灌胃（180mg/Kgbwt.）；第3組：3mL三聚氰酸（150mg/Kg bwt.）灌胃；第4組：1.5mL三聚氰胺（180mg/Kg bwt.）+1.5mL三聚氰酸（150mg/Kg bwt.）灌胃。1個月后，將各組實(shí)驗(yàn)動物處死、稱重，切除大鼠的腎臟、膀胱、肝臟、胃、心臟、脾臟、卵巢、子宮及睪丸并稱重。將各器官分三份，其中一份于4%多聚甲醛中固定，以備做組織學(xué)實(shí)驗(yàn)；另兩份于-80°冰箱冷凍保存，，以備做酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）及高效液相-質(zhì)譜（HPLC-MS）實(shí)驗(yàn)。通過組織切片及蘇木精-伊紅染色，觀察在三聚氰胺及三聚氰酸影響下組織器官的病理改變；間接競爭性抑制ELISA及HPLC-MS法確立三聚氰胺在各器官的分布，最終得到的大鼠器官三聚氰胺的濃度用ng/g來表達(dá)。 結(jié)果： 1．三聚氰胺和三聚氰酸的細(xì)胞毒性研究表明，三聚氰胺對NRK-52E細(xì)胞半數(shù)致死量是1.89mg/mL，對293T細(xì)胞2.07mg/mL；而三聚氰酸對NRK-52E細(xì)胞半數(shù)致死量是4.20mg/mL，對293T細(xì)胞是3.70mg/mL。 2．組織學(xué)研究表明，三聚氰胺-三聚氰酸聯(lián)合灌胃組腎臟的髓質(zhì)、皮質(zhì)區(qū)域產(chǎn)生土黃色的結(jié)晶，胃壁的主細(xì)胞缺失。三聚氰胺和三聚氰酸單獨(dú)灌胃組各器官無明顯形態(tài)學(xué)改變。 3．組織勻漿液ELISA檢測結(jié)果表明，腎、胃、子宮和睪丸的組織勻漿中，4組三聚氰胺含量為57.30±4.44ng/g，63.02±7.10ng/g，55.23±6.27ng/g和59.23±4.60ng/g，三聚氰酸的含量為59.79±5.24ng/g，58.44±1.58ng/g,56.74±1.29ng/g和64.14±1.10ng/g。 4．組織勻漿液HPLC-MS檢測結(jié)果表明：三聚氰胺組、三聚氰酸組及聯(lián)合灌胃組中各器官三聚氰胺含量均高于生理鹽水組，其中三聚氰胺-三聚氰酸聯(lián)合灌胃組腎臟三聚氰胺含量最高(296ng/g)，三聚氰胺組中腎臟受累最明顯（11.83ng/g），其次分別是子宮(9.6ng/g)和肝臟(6.8ng/g)。 結(jié)論： 1.組織學(xué)研究及HPLC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三聚氰胺與三聚氰酸聯(lián)合作用將形成網(wǎng)格狀的大型復(fù)合物，其毒性遠(yuǎn)強(qiáng)于三聚氰胺與三聚氰酸單獨(dú)作用，腎臟是主要的受累器官。 2． HPLC-MS檢測結(jié)果表明，三聚氰胺不僅對腎臟有影響，在子宮和肝臟也會有大量的沉積。 3.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三聚氰胺與其同類物三聚氰酸相比毒性更強(qiáng)，然而它們分別低劑量作用時毒性低。 4.酶聯(lián)免疫吸附法在檢測組織中三聚氰胺及其類似物的含量時是不可靠不靈敏的，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是較佳選擇。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R114

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本文編號：2553660