【摘要】：目的：流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)高濃度氡(Rn)暴露和肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。支氣管上皮細(xì)胞和細(xì)胞核DNA是氡及其子體作用的直接靶細(xì)胞和重要靶分子。線粒體在α粒子輻射旁效應(yīng)的調(diào)節(jié)中起重要作用,而線粒體DNA (mtDNA)是致癌物作用的重要靶點(diǎn)。本課題在建立的線粒體DNA敲除人支氣管上皮細(xì)胞(p-HBE)模型的基礎(chǔ)上,觀察氡及其子體照射對(duì)p-HBE細(xì)胞的損傷效應(yīng),同時(shí)采用高通量芯片技術(shù),篩選p+HBE與p-HBE細(xì)胞間以及氡染毒前后差異表達(dá)的mRNA和微小RNA (miRNA),為探討線粒體在氡致HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用溴化乙錠(EB)誘導(dǎo)法構(gòu)建p-HBE細(xì)胞株,并將其置于特制的氡染毒裝置中,氡暴露濃度為20, OOOBq/m3,染毒時(shí)間20min,染毒3d后重復(fù)染毒1次,連續(xù)染毒2次后作為染毒第1代(Rn1),分別染氡10代(Rn10)和30代(Rn30)。以線粒體正常的HBE細(xì)胞(p+HBE)為對(duì)照細(xì)胞,用Real-time PCR測(cè)定pHBE細(xì)胞氡染毒前后線粒體拷貝數(shù),活細(xì)胞探針標(biāo)記線粒體DNA數(shù)目、線粒體形態(tài)、線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平,用Annexin V和PI染色測(cè)定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變。選用6種細(xì)胞：p+HBE、p+HBE染氡10代細(xì)胞(低劑量染氡組)、p+HBE染氡30代細(xì)胞(高劑量染氡組)、p-HBE、p-HBE染氡10代(低劑量染氡組p-HBE)以及p-HBE染氡30代細(xì)胞(高劑量染氡組p-HBE),采用NimbleGen-135K mRNA表達(dá)譜芯片和miRCURYTM芯片篩選差異表達(dá)的mRNA和miRNA,并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：用EB誘導(dǎo)30d后,p+HBE細(xì)胞中的線粒體拷貝數(shù)減少了約77%,細(xì)胞漿內(nèi)mtDNA的數(shù)量顯著減少,線粒體膜電位降低,同時(shí)在無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)液中細(xì)胞開始大量死亡,表明EB已成功誘導(dǎo)線粒體DNA缺失,建立了p-HBE細(xì)胞。經(jīng)氡染毒后,p+HBE細(xì)胞生長(zhǎng)速率加快,克隆形成率和存活分?jǐn)?shù)明顯下降,而p"HBE細(xì)胞的克隆形成率和存活分?jǐn)?shù)卻明顯升高,提示線粒體DNA敲除后,p-HBE細(xì)胞更易受到氡暴露的損傷,可能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。p-HBE細(xì)胞中ROS水平低于p+HBE細(xì)胞,經(jīng)氡染毒后兩種類型細(xì)胞中ROS水平都顯著升高,但p-HBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平僅為p+HBE細(xì)胞的48%,提示除線粒體外,細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生還有其他的來(lái)源。p-HBE細(xì)胞的線粒體膜電位經(jīng)氡照射后顯著下降,表明線粒體的膜結(jié)構(gòu)和功能受到了嚴(yán)重?fù)p傷。p-HBE細(xì)胞染氡后的凋亡率有所升高但明顯低于p+HBE細(xì)胞,提示線粒體缺失細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)與其凋亡功能的降低存在密切的相關(guān)。p-HBE細(xì)胞在高劑量氡染毒后S期細(xì)胞增加,G1和G2/M期細(xì)胞減少,提示發(fā)生了G1期和G2/M期阻滯,延緩細(xì)胞進(jìn)入S期和M期的速度,導(dǎo)致細(xì)胞周期的延長(zhǎng)。mRNA表達(dá)譜的分析結(jié)果顯示,氡染毒致p+HBE細(xì)胞mRNA表達(dá)明顯上調(diào)的有TFF1、TFF2和IGHG1等,表達(dá)明顯下調(diào)的mRNA包括NCOA7,FN1, EGR1, IL-8, RASEF和BNDF等。GO通路分析表明,上調(diào)的]mRNA主要是影響信號(hào)傳導(dǎo)通路,下調(diào)的基因70%以上影響蛋白質(zhì)的結(jié)合和酶活性。在p-HBE細(xì)胞中,低劑量染氡組p-HBE上調(diào)變化最大的mRNA為SPRR家族中的SPRR2E、 SPRR2A、SPRR2D等,下調(diào)表達(dá)的基因包括HAND2和FCRLM1等。高劑量染氡組p"HBE上調(diào)變化最大的mRNA為BICC1、ASNA、KIAA1045等,表達(dá)下調(diào)的有GNAI3、TSGA2、BAX、PKP2、GNPDA1等。GO通路分析表明,這些上調(diào)和下調(diào)的mRNA主要功能是影響受體信號(hào)、信號(hào)傳導(dǎo)以及蛋白質(zhì)結(jié)合等通路。microRNA表達(dá)譜的分析結(jié)果顯示,氡暴露致p+HBE細(xì)胞miRNA表達(dá)上調(diào)的有miR-107, miR-3651和miR-3074-3p等,表達(dá)下調(diào)的有miR-1227以及miR486-5p等。氡暴露致p-HBE細(xì)胞miRNA表達(dá)上調(diào)的有miR-1919-5p、miR-3157-3p和miR-484等,表達(dá)下調(diào)的有miR-3607-3p,miR-98和miR-1275等。 結(jié)論：(1)采用EB誘導(dǎo)法成功構(gòu)建了mtDNA部分敲除的人支氣管上皮細(xì)胞株(p-HBE),并通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)缺陷和活細(xì)胞染色及檢測(cè)線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位的改變,了解了p-HBE細(xì)胞的生物學(xué)特性,為研究氡致線粒體DNA敲除細(xì)胞的損傷效應(yīng)提供了細(xì)胞模型。(2)氡染毒后,p-HBE細(xì)胞在生長(zhǎng)速度、ROS產(chǎn)生量、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期等生物學(xué)指標(biāo)上均出現(xiàn)了明顯改變,表明氡染毒后所產(chǎn)生的細(xì)胞損傷效應(yīng)與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙密切相關(guān),為進(jìn)一步從分子水平上探討氡致肺癌的發(fā)生機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。(3)通過(guò)高通量芯片篩選,發(fā)現(xiàn)了一批p+HBE與p-HBE細(xì)胞間以及氡染毒前后差異表達(dá)的mRNA和miRNA,對(duì)這些mRNA和miRNA進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析,將有助于闡明在氡致肺癌的過(guò)程中,核基因組和線粒體基因組所起的不同作用,以及可能涉及的基因網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2551191