【摘要】：喹乙醇(Olaquindox, OLA)系一種鄰硝基苯胺類抑菌促生長劑,廣泛用于動物疾病治療和畜牧業(yè)生產(chǎn)。隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,獸藥可以通過原型、代謝產(chǎn)物的形式借助于環(huán)境轉(zhuǎn)歸和食物鏈傳遞等途徑最終到達人體,損害人類健康。毒理學研究表明：喹乙醇具有遺傳毒性、生殖毒性、蓄積毒性和對肝、腎的靶器官毒性,歐盟已認定喹乙醇為致突變物和可疑致癌物。毒代動力學資料顯示,喹乙醇主要代謝途徑是經(jīng)腎臟排出,動物實驗也顯示其對腎臟的實質(zhì)性損傷。 人源腎小管上皮細胞(Human Kidneys, HK-2)來源于正常人腎小管近端上皮組織,保留了腎小管上皮細胞的多種酶學、電生理學和表型特征,是研究腎臟毒性作用機制的典型細胞系。 本研究以喹乙醇代謝產(chǎn)生活性氧為切入點,運用體外細胞培養(yǎng)的方法構(gòu)建HK-2細胞損傷模型,通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡標志蛋白的變化,初步探討喹乙醇對HK-2細胞毒效應(yīng)的作用機制,從體外角度為喹乙醇所致腎損傷的可能效應(yīng)路徑提供技術(shù)依據(jù)。 1.喹乙醇染毒濃度和時間對HK-2細胞凋亡的影響 1)喹乙醇對HK-2細胞有增殖抑制效應(yīng),24h ⅠCso值為6.8μmol/ml,R=0.9721; 2)與DMSO對照組比較,喹乙醇染毒1μmol/ml組細胞早期凋亡率無明顯變化(p0.05),喹乙醇染毒(2、3和4μmol/ml)組細胞早期凋亡率升高(p0.05),兩兩比較顯示：染毒2μmol/ml組和3μmol/ml組、3μmol/ml組和4μmol/ml組,組間細胞早期凋亡率有差異(p0.05),喹乙醇可呈劑量依賴性的誘發(fā)HK-2細胞凋亡； 3)與染毒0h的對照組比較,喹乙醇(3μmol/ml)染毒6h組細胞早期凋亡率無明顯變化(p0.05),染毒(12和24h)組細胞早期凋亡率升高(p0.05),兩兩比較顯示：染毒6h組和12h組、12h組和24h組,組間細胞早期凋亡率有差異(p0.05),喹乙醇可呈時間依賴性的誘發(fā)HK-2細胞凋亡。 2.喹乙醇染毒濃度和時間對HK-2細胞內(nèi)ROS含量的影響 1)與DMSO對照組比較,喹乙醇染毒(1、2、3和4μmol/ml)組細胞內(nèi)ROS含量均升高(p0.05),兩兩比較顯示：染毒1μmol/ml組和2μmol/ml組、2μmol/ml組和3μmol/ml組、3μmol/ml組和4μmol/ml組,組間細胞ROS含量有差異(p0.05),喹乙醇可呈劑量依賴性的誘發(fā)HK-2細胞內(nèi)ROS含量增加； 2)與染毒Oh對照組比較,喹乙醇(3μmol/ml)染毒(6、12和24h)組細胞內(nèi)ROS含量升高(p0.05),兩兩比較顯示：染毒6h組和12h組、12h組和24h組,組間細胞ROS含量有差異(p0.05),喹乙醇可呈時間依賴性的誘發(fā)HK-2細胞內(nèi)ROS含量增加。 3.喹乙醇對HK-2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡蛋白表達的影響 1)與DMSO對照組比較,喹乙醇染毒1μmol/ml組GRP94、GRP78、CHOP和Caspase-4蛋白表達無明顯變化(p0.05),喹乙醇染毒(2、3和4μmol/ml)組GRP94、GRP78、CHOP和Caspase-4蛋白表達升高(p0.05)； 2)與染毒0h對照組比較：喹乙醇(3μmol/ml)染毒6h組GRP94、GRP78和Caspase-4的蛋白表達量無明顯變化(p0.05),染毒(12和24h)組GRP94、 GRP78和Caspase-4的蛋白表達量升高(p0.05),染毒(6、12和24h)組CHOP的蛋白表達量升高(p0.05)： 3)喹乙醇可誘導HK-2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡標志性蛋白表達增加。 4.喹乙醇對HK-2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響 1)與DMSO對照組比較,喹乙醇染毒1和2μmol/ml組GRP94和GRP78的mRNA水平無明顯變化(p0.05),喹乙醇染毒(3和4μmol/ml)組GRP78和GRP94的mRNA水平上調(diào)(p0.05),喹乙醇染毒1μmol/ml組Caspase-4的mRNA水平無明顯變化(p0.05),喹乙醇染毒(2、3和4μmol/ml)組Caspase-4的mRNA水平上調(diào)(p0.05)； 2)與染毒0h對照組,喹乙醇(3μmol/ml)染毒6h組GRP78和Caspase-4mRNA水平無明顯變化(p0.05),染毒(12和24h)組GRP78和Caspase-4mRNA水平上調(diào)(p0.05),染毒(6、12和24h)組GRP94mRNA水平上調(diào)(p0.05)； 3)喹乙醇可誘導HK-2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡標志性蛋白轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)； 4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白GRP78、GRP94、Caspase-4蛋白表達變化與mRNA水平變化趨勢相似。 5.ROS抑制劑在喹乙醇(3μmol/ml)致HK-2細胞凋亡中的作用 1)NAC預處理組與對照組比較：細胞內(nèi)ROS含量、細胞早期凋亡率顯著均減少(p0.05), GRP94、GRP78、Caspase-4和CHOP蛋白表達量均減少(p0.05)； 2)喹乙醇誘導的HK-2細胞凋亡與細胞內(nèi)ROS增加有關(guān),ROS可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其凋亡的關(guān)鍵因素。
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 鄒家杰;張婷;湯樹生;陳倩;靳溪;陳開跑;肖希龍;;喹乙醇誘導HepG2細胞線粒體的氧化損傷[J];癌變.畸變.突變;2009年05期

2 張婷;陳倩;湯樹生;靳溪;鄒家杰;劉鳳英;張q，

本文編號：2535145