【摘要】：第一部分長(zhǎng)期α-亞麻酸干預(yù)對(duì)自然衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響目的：衰老是機(jī)體不可避免的一種正常而復(fù)雜的過程,認(rèn)知功能減退是其重要標(biāo)志之一。α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA)作為人體必需的一種不飽和脂肪酸,具有良好的神經(jīng)保護(hù)和抗衰老作用。本部分旨在探討長(zhǎng)期ALA攝入對(duì)自然衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。方法：將160只Specific-pathogen free(SPF)級(jí)6月齡雌性Sprague-Dewley大鼠(體重250-300g)隨機(jī)分為4組,即老年對(duì)照組(Aged),高脂對(duì)照組(high fat,HF),低劑量亞麻油干預(yù)組(L-ALA)和高劑量亞麻油干預(yù)組 (H-ALA).Aged組給予AIN-93M飼料,HF組給予10%(w/w)豬油高脂飼料；L-ALA組給予5%(w/w)豬油高脂飼料和5%(w/w)亞麻油；H-ALA組給予10%(w/w)亞麻油,持續(xù)喂養(yǎng)12個(gè)月。另外選擇30只相同來源和相同遺傳背景的3月齡雌性SD大鼠作為年輕對(duì)照組(Young),給予AIN-93M飼料喂養(yǎng)1個(gè)月。監(jiān)測(cè)各組大鼠每天的攝食量和每周體重,計(jì)算食物功效比(food effciency ratio,FER);采用Morris水迷宮測(cè)試評(píng)估老年大鼠(18月齡)和年輕大鼠(4月齡)的空間學(xué)習(xí)記憶能力；大鼠處死后,稱量主要臟器重量、HE和尼氏染色檢查腦組織病理學(xué)改變、氣相色譜法分析海馬和皮質(zhì)脂質(zhì)成分的改變。結(jié)果：對(duì)4組老年大鼠為期12個(gè)月的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯示,HF大鼠體重增量和攝食量均最多,并具有最高的FER(均為P0.05)；添加ALA后,大鼠體重增加減緩,攝食量減少,FER也降低。與Young組大鼠相比,Aged和HF組大鼠在定位巡航實(shí)驗(yàn)中到達(dá)平臺(tái)的潛伏期和路徑顯著延長(zhǎng)(均為P0.05),在空間探索試驗(yàn)中穿越目標(biāo)象限的時(shí)間和路徑均明顯減少(均為P0.05)；ALA干預(yù)能劑量依賴性地縮短大鼠的潛伏時(shí)間,并增加其在目標(biāo)象限的定位(均為P0.05)。病理檢查顯示Aged和HF大鼠腦組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的組織學(xué)異常改變和神經(jīng)元數(shù)目減少,而ALA處理能顯著減輕衰老和/或高脂引起的上述改變。脂質(zhì)成分分析顯示,與非ALA處理組(Young、 Aged和HF)相比,兩ALA干預(yù)組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)ALA及其代謝產(chǎn)物DHA和EPA含量均較明顯增加(均為P0.05),n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)水平上升而n-6 PUFAs減少,引起(n-6)/(n-3)比值下降,不飽和系數(shù)明顯升高(P0.05)。結(jié)論：長(zhǎng)期膳食ALA干預(yù)可調(diào)節(jié)自然衰老大鼠腦內(nèi)脂肪酸含量,保護(hù)神經(jīng)元,并改善老年學(xué)習(xí)記憶功能。第二部分長(zhǎng)期補(bǔ)充ALA活化海馬CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)自然衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制研究目的：突觸可塑性降低是年齡相關(guān)性學(xué)習(xí)記憶改變的主要機(jī)制,環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP-response element binding protein, CREB)在神經(jīng)元存活、記憶固化、突觸修飾等方面具有關(guān)鍵性的作用。本部分研究旨在探討膳食ALA改善年齡相關(guān)性的認(rèn)知障礙與CREB信號(hào)通路的關(guān)系及其潛在的分子機(jī)制。方法：將經(jīng)過Morris水迷宮測(cè)試的大鼠斷頭處死,迅速分離腦皮質(zhì)和海馬組織。應(yīng)用透射電子顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的改變；Western blot方法和real-time PCR方法檢測(cè)ALA對(duì)皮質(zhì)和海馬CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其上游調(diào)節(jié)因子細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)、蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅳ (calcium calmodulin kinase IV, CaMKIV)的表達(dá)。結(jié)果：神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示,Aged和HF組大鼠與Young組相比,神經(jīng)元內(nèi)突觸數(shù)明顯減少(均為P0.05),脂褐素沉積明顯,伴有突觸后致密物降低和突觸間隙的寬度增加(均為P0.05)：添加ALA能顯著改善衰老和／或高脂引起的突觸結(jié)構(gòu)的異常改變。腦功能蛋白檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),Aged和HF組大鼠較Young組海馬CREB-P表達(dá)水平降低,下游腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)mRNA和蛋白表達(dá)下降,其高親和力受體酪氨酸激酶B(tyrosine kinase B, TrkB)的磷酸化水平也降低(均為P0.05);給予ALA膳食能夠顯著增強(qiáng)CREB-BDNF-TrkB信號(hào)通路的表達(dá)(均為P0.05)。皮質(zhì)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)未受影響(P0.05)。對(duì)活化CREB的上游調(diào)節(jié)因子分析顯示,海馬ERK和Akt在各組的磷酸化狀態(tài)與CREB-P一致;而CaMKIV-P和PKA的表達(dá)未受影響。結(jié)論：衰老和高脂會(huì)降低海馬CREB信號(hào)通路的表達(dá),損害衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能；長(zhǎng)期膳食ALA干預(yù)可呈海馬依賴性地活化ERK和Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路,調(diào)節(jié)CREB活性,增強(qiáng)突觸可塑性,從而改善自然衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。第三部分長(zhǎng)期補(bǔ)充ALA調(diào)節(jié)PERK/eIF2a信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)自然衰老大鼠阿爾茨海默病樣改變的保護(hù)作用目的：細(xì)胞外p-淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ聚集沉淀形成的老年斑和細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化的Tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)作為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的典型病理特征,也發(fā)生于生理性老化的進(jìn)程中。近來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AD病變?cè)缙诎l(fā)生特定的保護(hù)作用。本研究旨在驗(yàn)證衰老進(jìn)程中是否出現(xiàn)AD樣病理改變,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在ALA改善AD樣病理中的作用機(jī)制。方法：將160只SPF級(jí)6月齡雌性Sprague-Dewley大鼠(體重250-300g)隨機(jī)分為4組,即老年對(duì)照組(Aged),高脂對(duì)照組(HF),低劑量亞麻油干預(yù)組(L-ALA)和高劑量亞麻油干預(yù)組(H-ALA)。Aged組給予AIN-93M飼料,HF組給予10%(w/w)豬油高脂飼料；L-ALA組給予5%(w/w)豬油高脂飼料和5%(w/w)亞麻油；H-ALA組給予10%(w/w)亞麻油,持續(xù)喂養(yǎng)12個(gè)月。另外選擇30只相同來源和相同遺傳背景的3月齡雌性SD大鼠作為年輕對(duì)照組(Young),給予AIN-93M飼料喂養(yǎng)1個(gè)月。處死大鼠后,制作腦組織切片進(jìn)行剛果紅和硫黃素T染色,觀察Aβ在腦實(shí)質(zhì)和血管的沉積：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ40和Aβ42水平;免疫組織化學(xué)法染色檢測(cè)腦內(nèi)磷酸化Tau蛋白(pS396-Tau)水平,觀察是否出現(xiàn)了AD樣病理改變；Western blot方法p-分泌酶(β-site APP-cleaving enzyme 1, BACE1)對(duì)p-淀粉樣前體蛋白(amyloid-β precursor protein, APP)的剪切,以及tau蛋白的上游調(diào)節(jié)分子糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的活化；同時(shí),檢測(cè)ER應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)的蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶／真核起始因子2α(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase/eukaryotic Initiation Factor 2α,PERK/eIF2α)信號(hào)分支(調(diào)控BACE1和GSK-3β活化的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)分子mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與Young組大鼠相比,Aged和HF組大鼠腦實(shí)質(zhì)和血管內(nèi)淀粉樣斑塊陽(yáng)性染色明顯增多(均為P0.05),并伴有淀粉樣血管變性;Tau-P的陽(yáng)性表達(dá)顯著升高(均為P0.05),表明自然衰老大鼠出現(xiàn)AD樣病理改變：ALA干預(yù)后能顯著減少腦實(shí)質(zhì)和血管中Aβ聚集引起的淀粉樣蛋白沉積,減輕Tau病理。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期補(bǔ)充ALA通過調(diào)節(jié)PERK/eIF2α信號(hào)通路,一方面,降低BACE1蛋白活性以減少APP生成Ap；另一方面,抑制GSK-3β的活化而減少Tau蛋白的磷酸化。結(jié)論：自然衰老進(jìn)程中腦內(nèi)出現(xiàn)了AD樣病理改變；長(zhǎng)期補(bǔ)充ALA能夠通過抑制ER應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)的PERK/eIF2α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,改善衰老相關(guān)的AD樣病理學(xué)癥狀。
【圖文】：

困４邋ＨＥ染色觀察ＡＬＡ對(duì)自然衰老巧型大Ｒ巧馬病理形態(tài)的影巧（ｎ邋＝邋３）逡逑注：放NB倍巧（海馬全圍４0ｘ，海馬ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３和ＤＧ區(qū)２０0ｘ）。逡逑３．３．２大Ｒ廟組織Ｎ加焌結(jié)果逡逑Ｎｉｓｓｌ染色（圖５）結(jié)果思示，Ｙｏｕｎｇ組大鼠大腦海馬各分區(qū)尼氏小體呈深藍(lán)色，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核淡藍(lán)色。Ａｇｅｄ組大鼠海馬神經(jīng)元明顯較Ｙｏｕｎｇ組減少，，胞漿深染．逡逑部分尼氏小體邊界模糊。ＨＦ組大鼠海馬神經(jīng)元胞漿呈深藍(lán)色，尼氏體分界不清，胞逡逑體塌陷或皺縮，胞核呈楠圓或Ｓ角形，神經(jīng)元周圍出現(xiàn)水腫。ＬＡＬＡ沮尼氏小體較逡逑ＨＦ姐X椂啵鸒H塌陷減少。Ｈ－ＡＬＡ組仍

本文編號(hào)：2534931