發(fā)布時(shí)間：2019-09-06 06:58

【摘要】：目的構(gòu)建人源三價(jià)砷甲基轉(zhuǎn)移酶(AS3MT)的基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)導(dǎo)UROtsa細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR),從人源HEK293細(xì)胞基因庫中擴(kuò)增出AS3MT基因,將AS3MT基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pRetro X-IRES-Zs Green1中,經(jīng)病毒包裝后,轉(zhuǎn)導(dǎo)UROtsa細(xì)胞,熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá),采用流式細(xì)胞儀篩選陽性克隆,半定量RT-PCR法檢測AS3MT mRNA表達(dá)水平,免疫印跡法檢測AS3MT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增AS3MT基因、限制性雙酶切及基因測序鑒定,證實(shí)AS3MT基因正確插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。以該載體轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞Retro Pack PT67后獲得的病毒液滴度106cfu/m L。將病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)UROtsa細(xì)胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率達(dá)50.00%。經(jīng)3次流式細(xì)胞分選儀篩選,獲得成功轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)GFP的URO-Retro X-AS3MT細(xì)胞株;半定量RT-PCR和免疫印跡檢測結(jié)果均表明所轉(zhuǎn)導(dǎo)的AS3MT基因在UROtsa細(xì)胞中成功表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建能高水平穩(wěn)定表達(dá)AS3MT基因的UROtsa細(xì)胞系,為研究AS3MT在砷的代謝、毒性和致癌性中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【作者單位】： 廣東省職業(yè)病防治院毒理實(shí)驗(yàn)所 廣東省職業(yè)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院;Department
【基金】：美國NIH/NIEHS基金資助項(xiàng)目(R21ES022329,R01ES022629) 廣東省職業(yè)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2012A061400007)
【分類號】：R114
，

本文編號：2532460