【摘要】：本研究建立沙門(mén)氏菌及其主要血清型的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）方法，，實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)氏菌及其主要致病血清型的快速分型檢測(cè)。 通過(guò)序列同源性比較，確定沙門(mén)氏菌的屬特異基因invE，及腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌三種血清型的血清型特異基因lygD、STM4495、fliC，并分別設(shè)計(jì)、合成特異LAMP擴(kuò)增引物，均包括內(nèi)引物對(duì)（FIP、BIP）和外引物對(duì)（F3、B3）。 分別挑取沙門(mén)氏菌三種血清型純培養(yǎng)單菌落，用煮沸法提取DNA模板。通過(guò)優(yōu)化LAMP法操作中的各種條件，確定該法的最佳反應(yīng)環(huán)境。分別選擇腸炎、鼠傷寒、豬霍亂沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株及幾種非沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，判斷所設(shè)計(jì)的沙門(mén)氏菌屬LAMP擴(kuò)增引物和三種血清型引物的特異性。分別將純培養(yǎng)2d的三種血清型菌株挑取單菌落，以生理鹽水10倍梯度逐步稀釋菌液，分別取各稀釋菌液100μL進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，同時(shí)分別取各稀釋菌液1mL提取DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測(cè)LAMP法靈敏度，擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用凝膠電泳和直接在產(chǎn)物中加入SYBR-Green I染料兩種方法檢測(cè)。同時(shí)對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較兩種方法的靈敏度強(qiáng)弱。根據(jù)沙門(mén)氏菌各血清型的傳播來(lái)源不同，分別選擇不同的無(wú)菌食品樣本人工添加目的菌種進(jìn)行LAMP法擴(kuò)增。結(jié)果顯示采用沙門(mén)氏菌屬特異性引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，能特異的檢出沙門(mén)氏菌三種血清型，而非沙門(mén)氏菌不能檢出；分別采用三種血清型特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，三種血清型之間無(wú)交叉反應(yīng)，且非沙門(mén)氏菌均不能檢出，表明所設(shè)計(jì)的沙門(mén)氏菌屬和血清型擴(kuò)增引物特異性強(qiáng)。LAMP法針對(duì)invE基因細(xì)菌純培養(yǎng)液檢出限為2.0×10~1CFU/mL，PCR法檢出限為2.33×10~3CFU/mL，而三種血清型細(xì)菌培養(yǎng)液LAMP法檢出限分別為2.33×101CFU/mL、1.67×10~1CFU/mL、1.33×10~1CFU/mL，PCR法檢出限分別為1.33×10~3CFU/mL、2.17×10~2CFU/mL、1.67×10~2CFU/mL，表明與PCR法相比，LAMP法的靈敏度高101~102倍。沙門(mén)氏菌屬及三種血清型模擬樣本檢出限分別為1.67×10~1CFU/mL、2.67×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL，基本與細(xì)菌純培養(yǎng)液檢出限一致，表明食品樣本中潛在的干擾物質(zhì)對(duì)LAMP反應(yīng)體系影響不大。綜上所述，LAMP法反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于食品中沙門(mén)氏菌及其主要血清型的快速檢測(cè)。
【圖文】：

圖 1-1 LAMP 引物位置示意圖Fig．1-1 LAMP primer position schemes步驟（6）形成的啞鈴型模板 F1 端向前延伸形成發(fā)卡狀 DNA 1C 區(qū)段與該結(jié)構(gòu)內(nèi)的 F1 區(qū)段互補(bǔ)配對(duì)，繼續(xù)引導(dǎo) DNA 的取被置換出的單鏈片段中的 B1C 區(qū)段與 B1 區(qū)段互補(bǔ)配對(duì)，再次，分別形成更長(zhǎng)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（9）和啞鈴型模板（12）。9）至（11）是莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 DNA 不斷地進(jìn)行擴(kuò)增延長(zhǎng)，最終物；步驟（12）至（15）與步驟（6）至（9）基本相同。

10圖 1-2 LAMP 原理示意圖[39]Fig．1-2 LAMP principle diagram一般實(shí)驗(yàn)流程包括：NCBI 的 GenBank 庫(kù)中檢索靶基因片段，并通過(guò)同源性分析軟件確定該片段與其他物種基因的同源性不高，應(yīng)用 LAMP 引物設(shè)計(jì)軟件引物組，進(jìn)行引物的合成、Bst DNA 聚合酶大片段及反應(yīng)體系其他試劑的準(zhǔn)備，反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果判定等[33]。
【學(xué)位授予單位】：武漢工業(yè)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R446.5;R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2524580