【摘要】：目的構(gòu)建人雌激素受體α亞型配體結(jié)合區(qū)(hERα-LBD)的原核表達(dá)載體,并進(jìn)行表達(dá)蛋白的活性鑒定。方法以hERα-LBD質(zhì)粒為模板,采用PCR方法擴(kuò)增hERα-LBD基因,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定后與T載體(pGEM-T-easy)連接,將連接物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,陽性菌落經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,和pET-28a(+)質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切,T4DNA連接酶連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-hERα-LBD,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109和BL21感受態(tài)細(xì)胞中。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)hERα-LBD融合蛋白;將雌二醇-牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)抗原(E2-BSA)與融合蛋白混合,通過電泳法鑒定hERα-LBD的雌激素配體結(jié)合活性。結(jié)果 PCR擴(kuò)增的hERα-LBD基因片段約為1.9kb,與預(yù)期目的片段大小一致。與T載體連接,形成pGM-T-hERα-LBD重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞,陽性菌落酶切和測(cè)序鑒定正確,與pET-28a(+)質(zhì)粒酶切后連接,成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET-28a(+)-hERα-LBD;在大腸桿菌中異源表達(dá)人雌激素受體ERα的配體結(jié)合區(qū)hERα-LBD蛋白。經(jīng)親和色譜法純化后,hERα-LBD蛋白的表達(dá)量可達(dá)250mg/L。電泳法證實(shí)hERα-LBD具有雌激素結(jié)合活性。結(jié)論成功構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET-28a(+)-hERα-LBD,hERα-LBD具有雌激素結(jié)合活性。
[Abstract]:Objective to construct the prokaryotic expression vector of human estrogen receptor 偽 subunit ligand binding domain (hER 偽-LBD) and identify the activity of the expressed protein. Methods the hER 偽-LBD gene was amplified by PCR using hER 偽-LBD plasmid as template. The PCR amplification product was identified and ligated with T vector (pGEM-T-easy). The ligator was transformed into receptive cells. The positive colony was identified by restriction enzyme digestion and sequencing, and the pET-28a () plasmid was double digested and ligated by T4DNA ligase respectively. The recombinant expression vector pET-28a ()-hER 偽-LBD, was constructed. Transformed into E. coli JM109 and BL21 receptive cells. Isopropyl-尾-D-galactoside (IPTG) induced the expression of hER 偽-LBD fusion protein in cells, and the estrogen ligand binding activity of hER 偽-LBD was identified by electrophoresis by mixing E2-bovine serum albumin (BSA) coupling antigen (E2-BSA) with fusion protein. Results the hER 偽-LBD gene fragment amplified by PCR was about 1.9 KB, which was consistent with the expected target fragment size. The recombinant plasmid pGM-T-hER 偽-LBD was formed and transformed into receptive cells. The positive bacteria were identified correctly by restriction endonuclease digestion and sequencing, and ligated with pET-28a () plasmid. The recombinant prokaryotic expression vector pET-28a ()-hER 偽-LBD; was successfully constructed and the ligand binding region hER 偽-LBD protein of human estrogen receptor ER 偽 was heterogeneously expressed in E. coli. After purification by affinity chromatography, the expression of hER 偽-LBD protein could reach 250 mg 路L ~ (- 1). It was confirmed by electrophoresis that hER 偽-LBD had estrogenic binding activity. Conclusion the recombinant prokaryotic expression vector pET-28a ()-hER 偽-LBD,hER 偽-LBD has estrogen binding activity.
【作者單位】： 包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院;包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;河北北方學(xué)院;北京科技大學(xué);
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20507002)資助
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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3 李杰,司紀(jì)亮;環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)簡(jiǎn)介[J];環(huán)境與健康雜志;2002年01期

4 杜克久,徐曉白;環(huán)境雌激素研究進(jìn)展[J];科學(xué)通報(bào);2000年21期

【共引文獻(xiàn)】

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7 劉紅霞;李瓊;吳風(fēng)林;;基于分子電性距離矢量的酚類結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系[J];湖北理工學(xué)院學(xué)報(bào);2015年03期

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10 韓蕊;燕瑾;趙利維;張金秀;王立安;;高產(chǎn)青霉素酰化酶巨大芽胞桿菌的誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J];微生物學(xué)通報(bào);2015年09期

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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2 趙炳順,鄒繼超,儲(chǔ)少崗,徐曉白,杜克久;小鼠子宮增重法檢測(cè)國(guó)產(chǎn)三氯殺螨醇的雌激素生物活性[J];環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào);2000年02期

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4 王極德,陳榮莉,蔣可,莊永輝;多氯聯(lián)苯(PCB)分析方法的研究——Ⅱ、我國(guó)多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品的分析鑒定與建立[J];環(huán)境科學(xué)叢刊;1981年11期

5 戴宗智;祝壽芬;張毓武;楊莉莉;;三氯殺螨醇的致畸性和致突變性研究[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;1987年04期

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9 鄧健蓓,陳萍,王字玲,陳常慶,蘇成芝;帶有蛋白標(biāo)簽的原核表達(dá)載體構(gòu)建[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1998年03期

10 張巧,趙國(guó)強(qiáng),劉紅梅,宮亞歐,丁蘭萍,薛樂勛,楊勝利;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年03期

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本文編號(hào)：2523077