【摘要】：目的觀察煙草煙霧冷凝物(cigarette smoke condensate, CSC)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE) Rap2B基因表達(dá)的影響及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的變化：1、觀察CSC急性染毒后16HBE細(xì)胞的毒性特征及對(duì)Rap2B基因表達(dá)的影響,推測(cè)Rap2B基因在急性染毒階段的作用,為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2、觀察Rap2B基因在CSC致16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的變化情況,探索Rap2B基因在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。3、觀察CSC染毒16HBE細(xì)胞后全基因組甲基化水平及Rap2B基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的變化情況。 方法1、設(shè)置溶劑對(duì)照(DMSO)、CSC0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.12mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml、0.24mg/ml、0.30mg/ml9個(gè)劑量組,染毒24h后,采用CCK-8法測(cè)定終點(diǎn),通過SPSS15.0軟件計(jì)算IC50。16HBE細(xì)胞暴露不同劑量CSC (CTRL、DMSO、1/8IC50、1/4IC50、1/2IC50、1IC50)4h、8h、12h、16h、20h、24h,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,熒光定量PCR檢測(cè)Rap2B基因mRNA表達(dá)水平,Western Blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。2、根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置溶劑對(duì)照組和1/8IC50劑量組,重復(fù)染毒30代,每代細(xì)胞染毒24h,通過染色體畸變分析、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定16HBE細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化程度及檢測(cè)mRNA和蛋白表達(dá)水平。3、以聯(lián)合亞硫酸氫鈉限制性內(nèi)切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)的方法檢測(cè)全基因組甲基化情況的變化；亞硫酸氫鹽測(cè)序(bisulfite genomic sequencing, BGS)的方法檢測(cè)Rap2B基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的變化。 結(jié)果1、CSC對(duì)16HBE細(xì)胞有毒性作用,通過軟件計(jì)算CSC染毒16HBE細(xì)胞24h的半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration50%, IC50)為0.08±0.006mg/ml。設(shè)置對(duì)照組(CTRL)、DMSO組、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml6個(gè)實(shí)驗(yàn)組。16HBE細(xì)胞暴露CSC24h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生一定改變,高劑量組細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則形狀；染毒20h及24h后,0.01mg/ml與0.02mg/ml劑量組Rap2B基因mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào),與DMSO組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),隨劑量組濃度增高,在0.08mg/ml組mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)至最低,與DMSO組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2、隨著染毒次數(shù)的增加,16HBE細(xì)胞染色體畸變率逐漸增加,P20與P30代細(xì)胞染色體畸變率分別為12%與18%,與對(duì)照組比較與統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P30代細(xì)胞的克隆數(shù)與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；裸鼠腫瘤形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射P30代細(xì)胞14d后可以發(fā)現(xiàn)肉眼可見腫瘤,至注射后28d的形成明顯腫瘤組織；慢性過程中P30代細(xì)胞Rap2B基因mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平穩(wěn)步增加,與DMSO組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3、慢性轉(zhuǎn)化過程中各代細(xì)胞全基因組總體甲基化變化情況,ALU片段：P10(14.8%)、P20(12.8%)、P30(13.1%)與DMSO組(13.0%)比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LINE-1片段：P10(55.3%)P20(49.8%)、P30(49.3%)與DMSO組(53.4%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LINE-1甲基化率呈下降趨勢(shì)；Rap2B基因啟動(dòng)子區(qū)表現(xiàn)出低甲基化。 結(jié)論1、Rap2B基因的表達(dá)在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系；隨著染毒濃度的改變呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),提示Rap2B基因可能作為CSC靶基因在其急性染毒過程中一定的作用。 2、CSC能夠惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞,具有一定的致癌作用。 3、Rap2B基因在16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)穩(wěn)步上升,提示與腫瘤的發(fā)生具有一定的聯(lián)系。 4、CSC慢性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞過程中,全基因組甲基化率在一定程度上發(fā)生改變；Rap2B基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況沒有明顯變化。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2515300