【摘要】：大氣環(huán)境中包含多種環(huán)境污染物,其中顆粒物和臭氧是較為常見(jiàn)的污染物。城市中顆粒物在交通高峰期濃度達(dá)到最高,臭氧是氮氧化物(NOx)和揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)的二次污染物,與光照有關(guān),一般在下午的時(shí)候達(dá)到最大值。在一天當(dāng)中,兩者的聯(lián)合暴露會(huì)發(fā)生,而暴露于多種不同的環(huán)境污染物對(duì)健康的損害效應(yīng)可能比暴露于單一污染物的毒性作用更強(qiáng),所以無(wú)論是對(duì)流行病學(xué)研究,還是對(duì)毒理學(xué)的生物機(jī)制研究來(lái)說(shuō),考慮兩者的聯(lián)合暴露對(duì)健康的影響有重要意義。根據(jù)以往的研究結(jié)果,既然顆粒物引起的心血管效應(yīng)機(jī)制涉及肺、心臟和血管系統(tǒng)等多個(gè)部分,因此我們并行檢測(cè)肺、心臟和動(dòng)脈的改變以評(píng)價(jià)臭氧和PM2.5暴露對(duì)肺、心血管系統(tǒng)的毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制。 直到目前為止,對(duì)于評(píng)價(jià)人類暴露于多種環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)仍然沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。我們的研究中采用亞急性的暴露(2次/周,共3周)來(lái)評(píng)價(jià)由不同劑量的PM2.5單獨(dú)暴露或者臭氧與不同劑量PM25聯(lián)合暴露對(duì)Wistar大鼠肺、心血管系統(tǒng)的損傷效應(yīng)。我們采用每次4小時(shí)的0.8ppm臭氧暴露和三個(gè)劑量的PM2.5(0.2、0.8和3.2mg/只)暴露。具體的暴露方法是,48只7周齡Wistar大鼠隨機(jī)分為8組,每組6只。PM2.5低、中、高劑量組每只動(dòng)物分別經(jīng)氣管滴注0.2、0.8和3.2mg的細(xì)顆粒物。臭氧和PM25聯(lián)合暴露低、中、高劑量組為大鼠先暴露于0.8ppm的臭氧4小時(shí),然后再氣管滴注0.2、0.8和3.2mg的細(xì)顆粒物。對(duì)照組為滴注相同體積(0.20m1)的生理鹽水,臭氧單獨(dú)暴露組為先0.8ppm臭氧暴露4小時(shí),然后滴注相同體積的生理鹽水。暴露前和暴露期間每周稱體重一次。暴露3次(暴露中期)24小時(shí)后,麻醉動(dòng)物,進(jìn)行心電圖(ECG)記錄,分析低頻(LF)、高頻(HF)、低頻/高頻(LF/HF)、總變異(TV)等反應(yīng)心率變異性(HRV)的參數(shù)。末次暴露24小時(shí)后,麻醉動(dòng)物,頸動(dòng)脈插管測(cè)定血壓(BP),同時(shí)進(jìn)行心電圖(ECG)記錄,分析HRV參數(shù)。然后腹主動(dòng)脈取血處死動(dòng)物,分別收集全血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)。檢測(cè)BALF中肺炎癥損傷指標(biāo)：腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)；肺上皮損傷指標(biāo)：乳酸脫氫酶(LDH)的活性和堿性磷酸酶(AKP)活性；肺滲透性指標(biāo)：總蛋白(TP)和白蛋白(TLB)；肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)：超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活力和丙二醛(MDA)含量；肺血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)：實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、和細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)mRNA基因表達(dá)及比色法測(cè)定BALF中一氧化氮(NO)。心臟血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)：實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定iNOS、eNOS、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和ICAM-1mRNA基因表達(dá)；心臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)：SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量。檢測(cè)胸主動(dòng)脈中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表達(dá)。測(cè)定血清中系統(tǒng)炎癥指標(biāo)：ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6和C－反應(yīng)蛋白(CRP),比色測(cè)定LDH和肌酸激酶(CK)；系統(tǒng)氧化應(yīng)激指標(biāo)：血清MDA；內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo)：ELISA法檢測(cè)血漿內(nèi)皮素-1(ET-1)、血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血清NO含量。取主支氣管、未灌洗的左肺、右心室心室肌和胸主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色組織學(xué)檢查,其中肺組織和心臟組織也通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察超微結(jié)構(gòu)。分析肺與心血管系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與心率變異性和炎癥反應(yīng)與血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性。另外,我們也分析了PM2.5單獨(dú)暴露和臭氧與PM2.5聯(lián)合暴露的肺、心血管毒性的暴露－反應(yīng)關(guān)系及兩種暴露方式的暴露-反應(yīng)相關(guān)性是否一致,進(jìn)而分析在肺及心血管系統(tǒng)內(nèi)部及兩者之間的分子病理機(jī)制的關(guān)聯(lián)性、臭氧暴露對(duì)顆粒物毒性效應(yīng)的影響及毒性作用通路的變化。 該研究的結(jié)果表明,在我們的研究中,臭氧和PM2.5暴露延緩了大鼠體重的增長(zhǎng)。PM25單獨(dú)暴露組的BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯增加。PM25的滴注引起肺泡灌洗液中TNF-α、 IL-6、LDH和總蛋白含量的明顯增加(P0.05)。臭氧單獨(dú)暴露沒(méi)有引起這些肺損傷指標(biāo)的顯著變化。但是,臭氧可以提高由PM2.5引起的大鼠肺組織的炎癥和病理改變。與對(duì)照組比較,不論是顆粒物的單獨(dú)暴露還是與臭氧的聯(lián)合暴露,肺組織中SOD和GSH-Px的活力均降低。而肺組織中反應(yīng)內(nèi)皮功能的iNOS、eNOS和ICAM-1mRNA基因表達(dá)則有不同的變化,其中,在高劑量的PM2.5單獨(dú)暴露組和3個(gè)聯(lián)合暴露組中iNOS基因表達(dá)明顯上調(diào),而eNOS在任何一種暴露方式的作用下均沒(méi)有明顯的改變。雖然PM2.5的單獨(dú)暴露沒(méi)有引起ICAM-1基因表達(dá)的明顯改變,但是在臭氧和PM2.5的聯(lián)合作用下,肺組織中的ICAM-1表達(dá)明顯上調(diào)。主支氣管的病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),除對(duì)照組外,其余暴露組均表現(xiàn)出不同程度的炎癥細(xì)胞增生、聚集及粘膜上皮細(xì)胞的脫落等病理變化。肺組織病理學(xué)結(jié)果表明,所有PM2.5暴露組均呈現(xiàn)不同程度的炎癥損傷,并隨暴露劑量的增加有加重的趨勢(shì)。肺的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)PM2.5對(duì)肺細(xì)胞的損傷主要體現(xiàn)在對(duì)肺泡II型細(xì)胞線粒體的病理影響,即造成線粒體的腫脹、空泡及增多等病變。 在對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷上,與對(duì)照組比較,暴露3周后,高劑量PM2.5(3.2mg/只)組的血壓明顯升高(P0.05),心率則無(wú)明顯改變。PM2.5單獨(dú)暴露組可以引起血清CRP、MDA、CK、ET-1含量和血壓的明顯增加及HRV參數(shù)的顯著降低。大鼠的臭氧單獨(dú)暴露沒(méi)有引起這些指標(biāo)的明顯改變。但是,臭氧和PM2.5的聯(lián)合暴露引起CRP, IL-6,CK, LDH和MDA劑量-效應(yīng)趨勢(shì)的增加及SOD和HRV以劑量－效應(yīng)趨勢(shì)的降低。同時(shí),在PM2.5單獨(dú)暴露及聯(lián)合暴露組中,ECG均表現(xiàn)出異常的放電類型。心臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),PM2.5暴露組中觀察到顆粒物的沉積,只有在高劑量的聯(lián)合暴露組中觀察到心肌炎癥。TEM的結(jié)果也表明臭氧單獨(dú)暴露、高劑量PM25暴露以及兩者的聯(lián)合作用可引起超微結(jié)構(gòu)的改變,主要是心肌結(jié)構(gòu)紊亂、肌絲的溶解斷裂、線粒體腫脹和空泡化。另外,PM25的單獨(dú)及與臭氧的聯(lián)合暴露均可以上調(diào)動(dòng)脈中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表達(dá)。說(shuō)明調(diào)節(jié)動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制和內(nèi)皮功能受到影響。但是在所有暴露組中,腹主動(dòng)脈的HE染色結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈的明顯病理變化。 肺及心血管系統(tǒng)毒性作用機(jī)制的關(guān)聯(lián)性分析表明,肺的炎癥效應(yīng)、心血管系統(tǒng)的炎癥／氧化應(yīng)激指標(biāo)與HRV參數(shù)之間存在顯著的相關(guān)性。血漿ET-1的含量與大鼠心臟組織中的MMP-2的表達(dá)沒(méi)有顯著的相關(guān)性,但與動(dòng)脈中MMP-2的表達(dá)顯著相關(guān)。PM2.5的單獨(dú)暴露與臭氧和PM25的聯(lián)合暴露兩組暴露方式的暴露-反應(yīng)相關(guān)性研究表明,對(duì)于檢測(cè)顆粒物的肺毒性效應(yīng),LDH、總蛋白、白蛋白、iNOS mRNA、SOD、 GSH-PX和MDA等指標(biāo)可能更為敏感,而臭氧對(duì)AKP、IL-6、ICAM-1mRNA等指標(biāo)的影響較大。兩種暴露方式對(duì)心血管系統(tǒng)影響的結(jié)果提示,CRP和ET-1等指標(biāo)對(duì)PM2.5暴露較為敏感,而TNF-α、IL-6和TV等指標(biāo)可能對(duì)于臭氧暴露更為敏感一些,VEGF則對(duì)PM2.5或臭氧的敏感性都較差。 總之,這一暴露劑量(0.8ppm)和暴露時(shí)間(2次/周,共3周)的臭氧對(duì)肺及心血管系統(tǒng)的損傷較小。高劑量的PM2.5能引起大鼠肺損傷,包括細(xì)胞毒性、白細(xì)胞浸潤(rùn)、前炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激以及組織病理變化。大鼠肺的損傷主要由PM2.5所引起,但同時(shí)這一效應(yīng)可被臭氧的聯(lián)合暴露所提高。同樣劑量的PM2.5單獨(dú)暴露也可以引起心血管系統(tǒng)炎癥和氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)皮功能和自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)的紊亂。臭氧和PM2.5可引起心臟組織和全身系統(tǒng)明顯的損傷,并且這種影響存在劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。所以在臭氧和PM25聯(lián)合作用于生物體時(shí),自主神經(jīng)系統(tǒng)和炎癥/氧化應(yīng)激反應(yīng)均參與到毒性的產(chǎn)生過(guò)程中。事實(shí)上,所有這些通路是相關(guān)聯(lián)的,當(dāng)評(píng)價(jià)臭氧和細(xì)顆粒物的毒性時(shí),很難區(qū)分每一個(gè)通路的獨(dú)立參與。
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圖片說(shuō)明： 文中展示），而在PM2.5的中劑量和高劑量單獨(dú)暴露組及臭氧與PM2.5的中劑量和高劑量聯(lián)合暴露組中可見(jiàn)顆粒物的沉積以及心肌炎癥，主要是單核細(xì)胞聚集（見(jiàn)圖2.5.1)。MlW對(duì)照組X 200V/?： 士、；；-'IT % 二 V 。--.氣-.、，、???■廣….廣,'■?' , 5 ■ *■ - ‘-、、^ ,■ - - .、、. ?廣? ?'■? , '■ ： - -Ml-jf-' ? > ? r" ‘ ，、-■?*、.、、? ? ?-. - -、，、. 、 I ■■,、，‘、?：；姆'<二>7:-: ■ , ? “、-, ；0:-、二.々.、廣、-、‘…：.：.^^- ： ^‘： ■：.----4?C<‘ -. - . ??‘ ：.? ‘‘ ‘‘ -- ‘ .■■ ‘ ‘ A., . ? , > V V . , ? ? _ --. ,、 .中劑量組X200 PMjs高劑量組X200臭氧+ PM2.S中劑量組X200 臭氧+ PM2.S高劑量組X200圖2.5.1大鼠心臟病理學(xué)觀察（HE染色）注：PM2.5單獨(dú)高劑量暴露組中箭頭指示為心肌炎癥，其他組中箭頭指示為顆粒物沉積。79
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圖片說(shuō)明： 2.胸主動(dòng)脈HE染色組織學(xué)檢查對(duì)照組和各個(gè)暴露組中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的病變（見(jiàn)圖2.5.2)。.. ".sn' ：'■ . ：. - - -■‘ ^ ? - I ..‘iff ‘、煖一mm-..對(duì)照組X 200 臭氧單獨(dú)暴露組X 200,甚. 榦廠:B ‘ fc- —. , , ,*' - ■■’■ r身:.r 'i'? .V、....廔：y'? .、、、?-、. I <廠"，/■、‘.、‘-V、、:- y? . ‘ ： ‘ * ^ ‘ i ‘-.、、.-? -? ? - ?/??-..‘心>/?■ ■ V :. ： \ .. ... ：：械..沒(méi)■ 二�！筳 /,-■ - !r:‘.吟高劑量組X200 臭氧+PM2.5高劑量組X200圖2.5.2大鼠胸主動(dòng)脈病理學(xué)觀察（HE染色）3.心臟組織的電鏡病理特征電子顯微鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu)的改變。在對(duì)照組中，，心肌結(jié)構(gòu)排列整齊，心肌細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體結(jié)構(gòu)正常。沒(méi)有心肌纖維化（圖2.5.3.A)。在臭氧單獨(dú)暴露組，心肌的某些位點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)肌絲溶解（圖中箭頭所示），細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與對(duì)照組基本相同（圖2.5.3.B)。在低劑量和中劑量PM2.5單獨(dú)暴露組中，心肌結(jié)構(gòu)正常（圖2.5.3.C-2.5.3.D)。但是，在聞劑量的PM2.5單獨(dú)暴露組中，心肌結(jié)構(gòu)紊亂、肌絲溶解和出現(xiàn)過(guò)度收縮帶（圖2.5.2.E)。在臭氧和低劑量的PM2.5暴露組中出現(xiàn)線粒體腫脹和心肌纖維化（圖2.5.3.F)。在聯(lián)合中劑量暴露組中
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：X51;R114

【參考文獻(xiàn)】

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