【摘要】：目的：本研究旨從細胞和整體水平研究miR-23b調控BDE47誘導CYP3A1表達、活性及功能的重要作用及分子機制,為深入闡述BDE47的生物毒效應及健康危害,并為環(huán)境污染物的健康風險評估提供理論依據和技術支撐。 方法：首先利用表達CYP3A1酶的大鼠H4ⅡE細胞株,通過CCK-8. Western Blot、 siRNA干擾、CYP3A誘導劑(地塞米松,DEX)處理和免疫熒光等試驗確定BDE47的毒性劑量及BDE47對CYP3A1的誘導作用。然后通過生物信息學預測和real-time PCR驗證,進一步確認目標mcroRNA (miR-23b),在此基礎上,運用雙熒光素酶報告基因實驗明確miR-23b和CYP3A1(大鼠)/CYP3A4(人)的靶向關系。然后利用microRNA的功能實驗(miR-23b過表達和抑制表達試驗)驗證miR-23b對CYP3A1/CYP3A4的調控作用。最后通過Lenti viral-anti-miR-23b漫病毒和BDE47聯合處理大鼠,檢測動物樣本miR-23b水平、CYP3A1表達水平和活性變化,以及GC-MS檢測樣本BDE47原形和代謝產物的含量,進一步驗證niR-23b在調控BDE47誘導CYP3A表達及其功能中的重要作用。 結果： 1.不同濃度的BDE47處理H4IIE細胞,可引起細胞活力呈劑量依賴性下降,DEX(CYP3A1誘導劑)預處理可明顯增強BDE47所致的細胞毒性；CYP3A1-siRNA轉染H4IIE細胞后,BDE47(20μM)的細胞毒性明顯下降。免疫熒光及Western Blot實驗顯示,BDE47可以顯著誘導CYP3A1的表達。 2.利用生物信息學軟件(miRanda-mirSVR、miRBase19、RNAhybrid、miRecords和PITA)初步確認了miR-23b可能與CYP3A的調控表達有關,研究結果顯示,BDE47處理的細胞及BDE47染毒的大鼠肝臟組織中,miR-23b都顯著下降。 3.報告基因實驗結果顯示,miR-23b可以分別和大鼠CYP3A1的3'UTR和人CYP3A4的CDS結合發(fā)揮調控作用,miRNA結合大鼠CYP3A1位點在3'UTR(+1620-+2790),而在人CYP3A4的CDS區(qū)的具體作用位點,分別位于(+450-+750)、(+1150-+1400)、(+1490-+1710)。 4. miR-23b mimic轉染H4ⅡE細胞24h后,CYP3A1的表達下降,BDE47的細胞毒性顯著降低；而miR-23b inhibitor處理,則CYP3A1表達升高,BDE47的細胞毒性顯著增強。 5.特異性抑制：miR-23b表達的micro-down'漫病毒和BDE47聯合處理大鼠,大鼠肝臟1niR-23b表達顯著減少,而CYP3A1蛋白表達和活性顯著升高；通過GC-MS檢測發(fā)現,抑制miR-23b表達后,BDE47染毒大鼠的血清和肝臟中BDE47原形的含量顯著下降,而血清中3種BDE47的代謝產物3-OH-BDE47、4'-OH-BDE49和4-OH-BDE42都顯著增加,但肝臟中的BDE47代謝產物未見明顯改變。 結論： 1.BDE47能夠誘導H4ⅡE細胞CYP3A1的表達,BDE47可通過誘導CYP3A1的表達而增強其毒效應。 2.證實：niR-23b與CYP3A的互補關系及結合靶點(大鼠CYP3A1的3’UTR和人CYP3A4的CDS區(qū)域),提出miR-23b可能在CYP3A的調控中發(fā)揮重要作用； 3.細胞和動物實驗證實了miR-23b可調節(jié)CYP3A1的表達,miR-23b可以通過調控CYP3A1表達及活性而影響B(tài)DE47的代謝并進而影響其毒效應。
[Abstract]:Objective: the purpose of this study was to study the important role and molecular mechanism of miR-23b regulating the expression, activity and function of CYP3A1 induced by BDE47 at the cellular and overall level, so as to provide theoretical basis and technical support for further expounding the biological toxic effects and health hazards of BDE47, and providing theoretical basis and technical support for health risk assessment of environmental pollutants. Methods: first, the rat H4 鈪，

本文編號：2499262