【摘要】：【目的】通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究不同粒徑納米氧化鋁誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡的方式，并且初步探討其主要的死亡方式。 【方法】1.觀查10nm氧化鋁和50nm氧化鋁粒子在溶液中的分散情況以及微米鋁顆粒和納米碳顆粒進(jìn)入細(xì)胞的情況：1）將50nm Al2O3，10nm Al2O3儲(chǔ)存液超聲10分鐘，在電鏡下觀察其分散情況；2）10nm-C，10μmAl2O3染毒細(xì)胞，終濃度為500μmM，觀察顆粒進(jìn)入細(xì)胞的情況。2.納米氧化鋁對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力及死亡方式的形態(tài)學(xué)觀察：1）原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，染毒，設(shè)空白對(duì)照組，10nm-C組，AlCl3鋁，10μmAl2O3組，50nmAl2O3組，10nmAl2O3組，染毒濃度為0.5mM繼續(xù)培養(yǎng)48h；2）檢測(cè)細(xì)胞活力；3）顯微鏡下觀察細(xì)胞；4）AO-EB雙染，觀察細(xì)胞凋亡與壞死；5）MDC染色觀察細(xì)胞自噬。3.透射電鏡確定納米氧化鋁誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的死亡方式：1）細(xì)胞培養(yǎng)，，染毒；2）收集細(xì)胞，制作電鏡標(biāo)本；3）電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。4.細(xì)胞凋亡與壞死的檢測(cè)：1）Annexin-V/7-AAD雙染法檢測(cè)神凋亡率與壞死率；2）分別檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3,Cyt-c和壞死相關(guān)基因Rip1,Nf-κB的表達(dá)情況。5.自噬的檢測(cè)：1）檢測(cè)自噬小體的發(fā)生情況；2）檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ和Atg-5的表達(dá)。6.染毒后分別加入凋亡特異性抑制劑zVAD-fmk，壞死特異性抑制劑Nec-1，自噬特異性抑制劑3-MA，分別檢測(cè)細(xì)胞活力。 【結(jié)果】1.觀查10nm氧化鋁和50nm納米氧化鋁粒子超聲后在溶液中的分散情況以及微米鋁顆粒和納米碳顆粒進(jìn)入細(xì)胞情況：1）納米氧化鋁經(jīng)超聲混勻后靜置前后納米顆粒的形狀及分散程度沒(méi)有明顯變化，符合實(shí)驗(yàn)染毒要求；2）納米碳和微米氧化鋁顆粒均可以進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞。2.納米氧化鋁對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力及死亡方式的形態(tài)學(xué)觀察：1）染毒細(xì)胞活力均有明顯下降（P0.05），且隨著氧化鋁粒徑的減小，細(xì)胞活力逐漸降低。2）鏡下觀察正常對(duì)照組和AlCl3組的細(xì)胞大小形態(tài)均一,胞膜完整,胞質(zhì)豐滿(mǎn),細(xì)胞連接豐富；10nm-C組和10μm Al2O3組,細(xì)胞減少，胞間連接減少甚至消失,胞膜破裂、胞質(zhì)濃縮,但細(xì)胞體基本完整，突觸變短，但清晰可見(jiàn)；50nmAl2O3組和10nmAl2O3組細(xì)胞數(shù)目少,細(xì)胞間連接中斷,細(xì)胞腫脹和細(xì)胞皺縮并存，細(xì)胞體不完整，突觸消失，且10nmAl2O3染毒組，細(xì)胞崩解，碎裂。3）AO-EB染色神經(jīng)細(xì)胞，可見(jiàn)正常對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞呈綠色的均勻熒光，有較多的軸突和樹(shù)突,沒(méi)有凋亡或壞死的細(xì)胞，10nm-C組和10μm Al2O3組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，染色質(zhì)聚集，固縮呈較濃的黃綠色，看到少量的凋亡和壞死細(xì)胞，在50nm Al2O3組、10nm Al2O3組有些神經(jīng)細(xì)胞的胞核染成鮮紅色或桔紅色熒光，并且胞漿也染成淡紅色，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清或溶解，胞膜破裂，細(xì)胞崩解，大量的凋亡和壞死細(xì)胞。4）正常對(duì)照組和AlCl3組，僅見(jiàn)到少量的MDC陽(yáng)性細(xì)胞，并且每個(gè)細(xì)胞中含的AV數(shù)量很少；10nm-C組和10μmAl_2O_3組，MDC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，每個(gè)細(xì)胞中AV數(shù)量也較多；50nmAl_2O_3組和10nmAl_2O_3組細(xì)胞數(shù)目少,胞體變圓，變大，MDC陽(yáng)性細(xì)胞布滿(mǎn)視野，且充溢著大量AV。3.電子顯微鏡下驗(yàn)證納米氧化鋁誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的死亡方式：通過(guò)對(duì)染毒后神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察可以確定其死亡方式有凋亡，壞死和自噬。4.細(xì)胞凋亡與壞死的檢測(cè)：1）空白組相比，10umAl_2O_3組、50nmAl_2O_3組和10nmAl_2O_3組的細(xì)胞凋亡率與壞死率顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），且隨著納米氧化鋁粒徑的減小，凋亡率與壞死率有遞增的趨勢(shì)。2）與空白組比，染毒組的凋亡相關(guān)基因Caspase-3,Cyt-c,壞死相關(guān)基因Rip1,Nf-κB表達(dá)均有變化，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有粒徑依賴(lài)性。5.自噬的檢測(cè)：1）與空白對(duì)照組相比，10umAl_2O_3組、50nm Al_2O_3組和10nm Al_2O_3組的細(xì)胞自噬小泡數(shù)量增加，平均熒光強(qiáng)度峰值向右偏移（P0.05），且隨著納米氧化鋁粒徑的減小，自噬率有遞增的趨勢(shì)。2）與對(duì)照組相比，染毒組自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ,ATG-5表達(dá)均增高（P0.05），且具有粒徑依賴(lài)性。6.細(xì)胞主要死亡方式的初步測(cè)定：加入3MA后，細(xì)胞損傷后修復(fù)程度最高。 【結(jié)論】1.納米氧化鋁使神經(jīng)細(xì)胞活力下降；2.納米氧化致神經(jīng)細(xì)胞死亡方式有凋亡壞死和自噬；3.納米氧化鋁致神經(jīng)細(xì)胞死亡程度具有粒徑依賴(lài)性，隨著其粒徑的減小，其損傷程度加重；4.初步認(rèn)定納米氧化鋁致神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式為自噬。
[Abstract]:[Objective] To study the way to induce the death of nerve cells with different particle size of nano-alumina by in vitro experiment, and to probe into the main methods of death. [Method] 1. To observe the dispersion of 10 nm alumina and 50 nm alumina particles in solution and the condition of micro-aluminum particles and nano-carbon particles to enter the cell:1) The 50 nm Al2O3 and 10 nm Al2O3 storage solution were sonicated for 10 minutes, and the dispersion was observed under the electron microscope;2)10 nm-C,10. m 1) detecting the occurrence of autophagy bodies;2) detecting the expression of autophagy related genes LC3-II and Atg-5. .[Results] 1. The dispersion of the 10 nm alumina and 50 nm nano-alumina particles in the solution and the entry of the micro-aluminum particles and the nano-carbon particles into the cell:1) The shape and the dispersion degree of the nano-alumina particles and the nano-carbon particles were not significantly changed after the ultrasonic mixing of the nano-alumina, and it was in accordance with the requirements of experimental exposure;2) Both the nano-carbon and the micron-sized alumina particles can enter the nerve cell.2) The morphology of the nano-alumina on the vitality of the nerve cells and the mode of death:1) The cell viability and the mode of death of the cells were observed:1) The cells were intact, the cytoplasm is full, the cell connection is rich, the cell membrane is broken, the cytoplasm is concentrated, but the cell body is basically intact, the synapse is short, but the cell body is clearly visible; the number of cells in the 50-nm-Al2O3 group and the 10-nnAl2O3 group is small, the intercell connection is interrupted, and the cell is swollen. In the normal control group and in the AlCl3 group, only a small amount of MDC positive cells were observed, and the number of AV in each cell was very small; the number of the AV in each cell was small; the number of AV in each cell was much higher; the number of cells in each cell was much higher; the number of cells in each cell was increased; the number of cells in the 50 nm Al _ 2O _ 3 group and the 10 nm Al _ 2O _ 3 group was small, the number of the cells in each cell was increased, and the MDC positive cells were filled with the field of view, and a large number of AV.3.3. The apoptosis, necrosis and autophagy of the cells were determined by the observation of the ultrastructure of the nerve cells after exposure. High.[Conclusion] 1. Nano-alumina has decreased the vitality of the nerve cells,2. The death of the nerve cells induced by nano-oxide has the effects of apoptosis and autophagy.3. The degree of cell death caused by the nano-alumina has a particle size dependence, and the degree of damage to the nerve cells is increased with the decrease of its particle size;4. The primary way of the preliminary determination of the death of the nerve cells caused by the nano-alumina is:
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2497187