【摘要】：黃曲霉毒素B1（AFB1）是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，在潮濕的環(huán)境中易于產(chǎn)生并污染食物，或存在于空氣中。據(jù)估計，全球發(fā)展中國家有超過5億人通過食物慢性暴露于黃曲霉毒素。早在1976年國際腫瘤研究機構(gòu)就確認黃曲霉毒素類化合物可以致癌，并于2002年將AFB1定為Ⅰ類強致癌物。AFB1主要通過攝入被污染的食物和水引發(fā)肝臟毒性，但前期研究表明在收獲、運輸、儲存和加工受黃曲霉毒素污染的農(nóng)作物過程中，AFB1也可以存在于空氣中并以細小微粒的形式經(jīng)人的呼吸道吸入產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)毒性。流行病學調(diào)查顯示在吸入受AFB1污染的花生塵人群中，肝癌和肺癌的發(fā)生有顯著增加。實驗動物學證據(jù)顯示AFB1也可以誘導肺和氣道組織腫瘤。 AFB1并非直接致癌物，需要在體內(nèi)經(jīng)過代謝活化，其經(jīng)過Ⅰ相代謝酶環(huán)氧化后可生成兩種環(huán)氧化異構(gòu)體，外環(huán)氧化物（exo-8,9-epoxide）和內(nèi)環(huán)氧化物（endo-8,9-epoxide）。這兩種異構(gòu)體的活性和致癌性差異顯著，其中exo-8,9-epoxide與DNA等大分子的親和力比endo-8,9-epoxide起碼大1000倍。exo-8,9-epoxide與DNA結(jié)合生成加合物可引發(fā)一系列遺傳損傷。CYP1A2和CYP3A4是AFB1公認的優(yōu)勢代謝酶，主要表達于人肝臟，肺臟幾乎不表達。前期研究表明在人呼吸道和肺臟中特異性高表達的CYP2A13也可以高效代謝活化AFB1，生成包括epoxides在內(nèi)的多種活性代謝產(chǎn)物。但與CYP1A2和CYP3A4相比較，CYP2A13對AFB1的具體環(huán)氧化產(chǎn)物異構(gòu)體種類不明確，且AFB1經(jīng)CYP2A13的代謝活化與呼吸系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的關(guān)系及其機制尚不清楚。 通過異源表達獲得純CYP亞型酶是開展化學物體外代謝的主要手段，其中桿狀病毒昆蟲細胞（Baculovirus/sf9）表達系統(tǒng)可以高水平表達多種原始的CYP450蛋白，但此系統(tǒng)缺少CYP450酶合成所必需的血紅素因子以及發(fā)揮催化作用時的電子供體POR蛋白，需要進行優(yōu)化。采用重組代謝酶，體外重建代謝系統(tǒng)，模擬人體內(nèi)環(huán)境，對外源化合物進行孵育，然后再采用先進大型儀器進行檢測是目前體外代謝酶功能研究和藥物篩選應(yīng)用較廣泛的方法。此外，人肺支氣管上皮細胞（BEAS-2B）是來源于人支氣管上皮組織的永生化細胞株，本身不表達AFB1代謝相關(guān)的CYP450酶類，但保持了較好的鱗狀分化能力，是用來研究化學物誘導或影響細胞分化、致癌等效應(yīng)的合適的細胞模型。 綜上所述，為了研究CYP2A13對AFB1的具體代謝產(chǎn)物種類和AFB1經(jīng)CYP2A13代謝活化后引發(fā)呼吸系統(tǒng)腫瘤的具體分子機制：⑴在Baculovirus/sf9表達系統(tǒng)中加入不同的血紅素，評價不同條件對CYP2A13和POR蛋白表達的影響，從而優(yōu)化體外表達高活性CYP2A13的條件，同時嘗試與CYP450酶的電子供體POR蛋白共表達，以獲得高活性的CYP2A13蛋白；⑵利用優(yōu)化的體外表達方法表達了AFB1代謝相關(guān)的CYP450蛋白，然后構(gòu)建體外代謝體系，成功代謝AFB1，采用HPLC和HPLC-Q-TOF檢測CYP2A13對AFB1的代謝活性以及環(huán)氧化代謝產(chǎn)物種類；⑶篩選了穩(wěn)定表達CYP2A13的永生化人肺支氣管上皮細胞（BEAS-2B）的單克隆株，用低水平AFB1連續(xù)處理40代，得到低水平AFB1致惡性轉(zhuǎn)化細胞株，然后檢測DNA損傷修復以及凋亡相關(guān)蛋白表達情況，以探討低水平AFB1導致穩(wěn)定表達CYP2A13的BEAS-2B細胞株惡性轉(zhuǎn)化的機制。 第一部分CYP2A13體外表達條件的優(yōu)化 在Baculovirus/sf9表達系統(tǒng)中加入5-ALA、hemin等血紅素輔助因子可以成功表達有活性的CYP450s蛋白。但對于此類輔助因子的具體加入方式，種類以及濃度存在爭議。此外，功能性CYP450蛋白的異源表達除了需要有完整的細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)、正確的蛋白糖基化、分泌、組織定位表達以及血紅素等輔助因子參與外，其活性的發(fā)揮還需要細胞色素P450氧化還原酶（POR）、NADPH等輔酶為其提供電子。為了在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中高效表達有活性的CYP2A13蛋白，我們首先構(gòu)建了含CYP2A13和POR的cDNA的重組桿狀病毒DNA；利用含CYP2A13基因或POR基因的桿狀病毒感染sf9細胞，然后在培養(yǎng)液中加入不同濃度和不同組合的5-ALA、檸檬酸鐵（Fe~(3+)）或hemin，分析了不同條件對CYP2A13和POR蛋白表達和活性的影響；最后我們嘗試了在細胞培養(yǎng)液中同時加入含CYP2A13基因和POR基因的桿狀病毒共同感染sf9細胞，對CYP2A13和POR蛋白進行共表達。 結(jié)果顯示，不同濃度和不同組合的血紅素輔助因子可以影響CYP2A13和POR蛋白在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中的表達。其中在培養(yǎng)液中分別加入0.2mM5-ALA、0.02mM Fe~(3+)或1μg/ml hemin得到的CYP2A13蛋白單獨表達量最高，而聯(lián)合加入0.2mM5-ALA和0.02mM Fe~(3+)時比單獨加入得到的CYP2A13蛋白活性和表達量更高，且差異有顯著性（P 0.01），同時該方法也可以得到活性最高的POR蛋白。不同的病毒比例對CYP2A13蛋白的表達有顯著影響。其中當病毒比例為5:2（bvCYP2A13：bvPOR）時，CYP2A13蛋白的活性最高，跟其它組比差異有統(tǒng)計學意義（P 0.01）。 因此，我們認為在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中聯(lián)合加入0.2mM5-ALA和0.02mMFe~(3+)，同時與POR蛋白以病毒比例為5:2（bvCYP2A13：bvPOR）共感染，最適合CYP2A13在該系統(tǒng)中的表達，可得到高表達量、有酶活性、天然不需修飾的CYP2A13蛋白。 第二部分CYP2A13對AFB1的體外代謝活性研究 建立體外模型研究代謝酶與特異性底物的關(guān)系，可排除體內(nèi)因素干擾，直觀酶對底物的選擇代謝性，且能明確地檢測代謝產(chǎn)物種類。體外重組高CYP450活性的代謝系統(tǒng)可以得到高產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物，方便對代謝產(chǎn)物種類和生成量進行分析。雖然前期的體外代謝研究初步證實了CYP2A13可代謝AFB1生成包括AFB1-diol和AFM_1-diol（epoxide的水化合物形式）在內(nèi)的數(shù)十種代謝產(chǎn)物，但許多代謝產(chǎn)物尚未完全明確。同時，跟AFB1的優(yōu)勢代謝酶CYP1A2和CYP3A4相比，CYP2A13對AFB1的代謝活力強度還不知道，且環(huán)氧化代謝產(chǎn)物生成量不明確。 為了研究CYP2A13在體外代謝系統(tǒng)中對AFB1的代謝特征，我們首先利用第一部分建立的方法，在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中對AFB1代謝相關(guān)的CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6和CYP2A13蛋白與POR蛋白進行了共表達；然后利用商品化的CYP1A2和CYP3A4蛋白代謝AFB1建立體外代謝孵育體系，同時建立AFB1及其產(chǎn)物AFM_1的HPLC前處理方法和檢測方法；最后利用體外表達的各種蛋白代謝AFB1，并對其代謝清除率和環(huán)氧化代謝產(chǎn)物進行檢測。 結(jié)果顯示，我們建立的體外代謝孵育系統(tǒng)可成功的代謝AFB1；通過三氟乙酸衍生化和HPLC-熒光檢測器聯(lián)用可較好的用于AFB1及其代謝產(chǎn)物的檢測；我們體外表達的CYP1A2、CYP3A4和CYP2A13都可體外代謝清除AFB1，其中CYP2A13在60分鐘內(nèi)對5μM的AFB1清除率最高，達到了約80%；經(jīng)HPLC-Q-TOF檢測，CYP2A13可以代謝AFB1生成exo-8，9-epoxide。 因此，我們認為CYP2A13對低劑量的AFB1清除率最高，甚至比公認的AFB1低濃度優(yōu)勢代謝酶CYP1A2更高，其活性代謝產(chǎn)物主要為AFB1exo-8，9-epoxide。 第三部分AFB1對穩(wěn)定表達CYP2A13的BEAS-2B細胞的惡性轉(zhuǎn)化效應(yīng)及其機制 流行病學和實驗動物學都證明吸入被AFB1污染的粉塵或食物攝入AFB1可導致呼吸系統(tǒng)腫瘤。在AFB1毒性發(fā)揮過程中，其代謝產(chǎn)物AFB1exo-8,9-epoxide（AFBO）與DNA分子共價結(jié)合形成AFB1-DNA，從而對DNA造成包括雙鏈斷裂在內(nèi)的損傷。這種損傷在肝臟中主要通過激活癌基因Ras，抑制抑癌基因P53表達，促進細胞增殖、分化，從而誘發(fā)肝癌。但AFB1導致呼吸系統(tǒng)腫瘤的具體分子機制還不明確。 為了研究AFB1導致呼吸系統(tǒng)腫瘤的具體分子機制，我們首先對穩(wěn)定表達AFB1代謝相關(guān)CYP450酶的人肺支氣管上皮細胞株（BEAS-2B）進行單克隆挑選，構(gòu)建單克隆細胞株；然后選擇對細胞無明顯毒性的AFB1濃度對該細胞株進行持續(xù)處理，構(gòu)建AFB1致穩(wěn)定表達CYP2A13的BEAS-2B（B-2A13）細胞惡性轉(zhuǎn)化模型；然后采用該惡性轉(zhuǎn)化模型，對AFB1致細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)分子機制進行驗證。 結(jié)果表明，各單克隆細胞株CYP450酶蛋白表達水平較一致；經(jīng)MTT法測定發(fā)現(xiàn)AFB1對穩(wěn)定表達不同CYP450酶的細胞株毒性不同，其中以B-2A13的敏感性最強，甚至比B-1A2細胞更敏感。我們選用0.1nM、1nM和10nM AFB1連續(xù)處理細胞40代，經(jīng)軟瓊脂克隆形成和裸鼠成瘤實驗驗證，B-2A13細胞在0.1nM處理40代時就發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化； Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)AFB1持續(xù)處理，細胞的同源重組和非同源重組相關(guān)DNA損傷修復蛋白都呈現(xiàn)高表達；而促凋亡蛋白在處理早期高表達，隨著細胞惡性轉(zhuǎn)化表達量降低甚至失表達；此外Raf/MEK/ERK信號通路和PI3K/Akt信號通路中的Ras、Raf、ERK和Akt等關(guān)鍵蛋白都被激活。 因此，我們認為低水平AFB1經(jīng)過CYP2A13代謝后生成的AFB1exo-8,9-epoxide與B-2A13細胞的DNA結(jié)合生成加合物，這種加合物可累積并導致DNA雙鏈斷裂，從而激活和招募同源重組和非同源粘性末端連接重組通路相關(guān)蛋白進行修復；在處理早期，細胞對此類損傷不能修復，從而誘發(fā)細胞發(fā)生凋亡；但隨著原癌基因Ras、Raf、ERK的激活，細胞的增殖和抗DNA損傷能力增強，同時激活了Raf/MEK/ERK信號通路和PI3K/Akt信號通路，使得細胞抗凋亡能力增強，，最終導致了細胞惡性轉(zhuǎn)化。 結(jié)論 1.在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中聯(lián)合加入0.2mM5-ALA和0.02mM Fe~(3+)，同時與POR蛋白以病毒比例為5:2（bvCYP2A13：bvPOR）共感染，最適合CYP2A13在該系統(tǒng)中的表達，可得到高表達量、有酶活性、天然不需修飾的CYP2A13蛋白。 2.采用體外CYP450酶異源表達系統(tǒng)可成功構(gòu)建AFB1的體外代謝孵育系統(tǒng)，CYP2A13在體外代謝系統(tǒng)中可成功代謝AFB1，在5μM濃度時CYP2A13對AFB1的清除率比CYP1A2還要高，其活性代謝產(chǎn)物主要為AFB1exo-8，9-epoxide。 3.0.1nM的AFB1可導致B-2A13細胞惡性轉(zhuǎn)化，并具有致瘤性。其機制可能與激活Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號通路，進而促進細胞增殖、增強抗凋亡能力等有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 裴利霞;杜冠華;;藥物代謝動力學研究進展[J];中國醫(yī)藥導刊;2006年05期

2 蘇建家,李瑗,班克臣,覃柳亮,王輝云,楊春,歐超,嚴瑞琪;動態(tài)研究HBV和AFB_1誘發(fā)樹鼠句肝細胞癌過程中一些基因的表達[J];廣西醫(yī)科大學學報;2001年02期

3 程婕;龔毅;楊凌;;細胞色素P450酶系的異源表達研究[J];河北大學學報(自然科學版);2006年03期

4 陳可和,劉三震,丁志敏,陳振祥,陸合明,龐強,張法燦,李瑤;廣西肝癌高低發(fā)病區(qū)p53基因突變熱點的對比研究[J];腫瘤防治雜志;2003年05期

5 高秀芬;蔭士安;張宏元;韓春卉;趙熙;計融;;中國部分地區(qū)玉米中4種黃曲霉毒素污染調(diào)查[J];衛(wèi)生研究;2011年01期

6 高秀芬;蔭士安;計融;;中國部分地區(qū)花生中4種黃曲霉毒素污染調(diào)查[J];中國公共衛(wèi)生;2011年05期

7 陳燕,柳曉泉,王廣基;創(chuàng)新藥物藥動學高通量篩選[J];中國藥科大學學報;2003年04期

8 班克臣,曹驥,楊春,歐超,蘇建家,李瑗,岳惠芬,段小嫻;Survivin在AFB1高暴露地區(qū)肝細胞癌中的表達及其臨床意義[J];中國腫瘤臨床;2005年11期

本文編號：2466234