【摘要】：黃曲霉毒素B1（AFB1）是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，在潮濕的環(huán)境中易于產(chǎn)生并污染食物，或存在于空氣中。據(jù)估計(jì)，全球發(fā)展中國(guó)家有超過(guò)5億人通過(guò)食物慢性暴露于黃曲霉毒素。早在1976年國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)就確認(rèn)黃曲霉毒素類(lèi)化合物可以致癌，并于2002年將AFB1定為Ⅰ類(lèi)強(qiáng)致癌物。AFB1主要通過(guò)攝入被污染的食物和水引發(fā)肝臟毒性，但前期研究表明在收獲、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和加工受黃曲霉毒素污染的農(nóng)作物過(guò)程中，AFB1也可以存在于空氣中并以細(xì)小微粒的形式經(jīng)人的呼吸道吸入產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)毒性。流行病學(xué)調(diào)查顯示在吸入受AFB1污染的花生塵人群中，肝癌和肺癌的發(fā)生有顯著增加。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)證據(jù)顯示AFB1也可以誘導(dǎo)肺和氣道組織腫瘤。 AFB1并非直接致癌物，需要在體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝活化，其經(jīng)過(guò)Ⅰ相代謝酶環(huán)氧化后可生成兩種環(huán)氧化異構(gòu)體，外環(huán)氧化物（exo-8,9-epoxide）和內(nèi)環(huán)氧化物（endo-8,9-epoxide）。這兩種異構(gòu)體的活性和致癌性差異顯著，其中exo-8,9-epoxide與DNA等大分子的親和力比endo-8,9-epoxide起碼大1000倍。exo-8,9-epoxide與DNA結(jié)合生成加合物可引發(fā)一系列遺傳損傷。CYP1A2和CYP3A4是AFB1公認(rèn)的優(yōu)勢(shì)代謝酶，主要表達(dá)于人肝臟，肺臟幾乎不表達(dá)。前期研究表明在人呼吸道和肺臟中特異性高表達(dá)的CYP2A13也可以高效代謝活化AFB1，生成包括epoxides在內(nèi)的多種活性代謝產(chǎn)物。但與CYP1A2和CYP3A4相比較，CYP2A13對(duì)AFB1的具體環(huán)氧化產(chǎn)物異構(gòu)體種類(lèi)不明確，且AFB1經(jīng)CYP2A13的代謝活化與呼吸系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的關(guān)系及其機(jī)制尚不清楚。 通過(guò)異源表達(dá)獲得純CYP亞型酶是開(kāi)展化學(xué)物體外代謝的主要手段，其中桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞（Baculovirus/sf9）表達(dá)系統(tǒng)可以高水平表達(dá)多種原始的CYP450蛋白，但此系統(tǒng)缺少CYP450酶合成所必需的血紅素因子以及發(fā)揮催化作用時(shí)的電子供體POR蛋白，需要進(jìn)行優(yōu)化。采用重組代謝酶，體外重建代謝系統(tǒng)，模擬人體內(nèi)環(huán)境，對(duì)外源化合物進(jìn)行孵育，然后再采用先進(jìn)大型儀器進(jìn)行檢測(cè)是目前體外代謝酶功能研究和藥物篩選應(yīng)用較廣泛的方法。此外，人肺支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）是來(lái)源于人支氣管上皮組織的永生化細(xì)胞株，本身不表達(dá)AFB1代謝相關(guān)的CYP450酶類(lèi)，但保持了較好的鱗狀分化能力，是用來(lái)研究化學(xué)物誘導(dǎo)或影響細(xì)胞分化、致癌等效應(yīng)的合適的細(xì)胞模型。 綜上所述，為了研究CYP2A13對(duì)AFB1的具體代謝產(chǎn)物種類(lèi)和AFB1經(jīng)CYP2A13代謝活化后引發(fā)呼吸系統(tǒng)腫瘤的具體分子機(jī)制：⑴在Baculovirus/sf9表達(dá)系統(tǒng)中加入不同的血紅素，評(píng)價(jià)不同條件對(duì)CYP2A13和POR蛋白表達(dá)的影響，從而優(yōu)化體外表達(dá)高活性CYP2A13的條件，同時(shí)嘗試與CYP450酶的電子供體POR蛋白共表達(dá)，以獲得高活性的CYP2A13蛋白；⑵利用優(yōu)化的體外表達(dá)方法表達(dá)了AFB1代謝相關(guān)的CYP450蛋白，然后構(gòu)建體外代謝體系，成功代謝AFB1，采用HPLC和HPLC-Q-TOF檢測(cè)CYP2A13對(duì)AFB1的代謝活性以及環(huán)氧化代謝產(chǎn)物種類(lèi)；⑶篩選了穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的永生化人肺支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）的單克隆株，用低水平AFB1連續(xù)處理40代，得到低水平AFB1致惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，然后檢測(cè)DNA損傷修復(fù)以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，以探討低水平AFB1導(dǎo)致穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的BEAS-2B細(xì)胞株惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制。 第一部分CYP2A13體外表達(dá)條件的優(yōu)化 在Baculovirus/sf9表達(dá)系統(tǒng)中加入5-ALA、hemin等血紅素輔助因子可以成功表達(dá)有活性的CYP450s蛋白。但對(duì)于此類(lèi)輔助因子的具體加入方式，種類(lèi)以及濃度存在爭(zhēng)議。此外，功能性CYP450蛋白的異源表達(dá)除了需要有完整的細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、正確的蛋白糖基化、分泌、組織定位表達(dá)以及血紅素等輔助因子參與外，其活性的發(fā)揮還需要細(xì)胞色素P450氧化還原酶（POR）、NADPH等輔酶為其提供電子。為了在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中高效表達(dá)有活性的CYP2A13蛋白，我們首先構(gòu)建了含CYP2A13和POR的cDNA的重組桿狀病毒DNA；利用含CYP2A13基因或POR基因的桿狀病毒感染sf9細(xì)胞，然后在培養(yǎng)液中加入不同濃度和不同組合的5-ALA、檸檬酸鐵（Fe~(3+)）或hemin，分析了不同條件對(duì)CYP2A13和POR蛋白表達(dá)和活性的影響；最后我們嘗試了在細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)加入含CYP2A13基因和POR基因的桿狀病毒共同感染sf9細(xì)胞，對(duì)CYP2A13和POR蛋白進(jìn)行共表達(dá)。 結(jié)果顯示，不同濃度和不同組合的血紅素輔助因子可以影響CYP2A13和POR蛋白在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中的表達(dá)。其中在培養(yǎng)液中分別加入0.2mM5-ALA、0.02mM Fe~(3+)或1μg/ml hemin得到的CYP2A13蛋白單獨(dú)表達(dá)量最高，而聯(lián)合加入0.2mM5-ALA和0.02mM Fe~(3+)時(shí)比單獨(dú)加入得到的CYP2A13蛋白活性和表達(dá)量更高，且差異有顯著性（P 0.01），同時(shí)該方法也可以得到活性最高的POR蛋白。不同的病毒比例對(duì)CYP2A13蛋白的表達(dá)有顯著影響。其中當(dāng)病毒比例為5:2（bvCYP2A13：bvPOR）時(shí)，CYP2A13蛋白的活性最高，跟其它組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.01）。 因此，我們認(rèn)為在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中聯(lián)合加入0.2mM5-ALA和0.02mMFe~(3+)，同時(shí)與POR蛋白以病毒比例為5:2（bvCYP2A13：bvPOR）共感染，最適合CYP2A13在該系統(tǒng)中的表達(dá)，可得到高表達(dá)量、有酶活性、天然不需修飾的CYP2A13蛋白。 第二部分CYP2A13對(duì)AFB1的體外代謝活性研究 建立體外模型研究代謝酶與特異性底物的關(guān)系，可排除體內(nèi)因素干擾，直觀酶對(duì)底物的選擇代謝性，且能明確地檢測(cè)代謝產(chǎn)物種類(lèi)。體外重組高CYP450活性的代謝系統(tǒng)可以得到高產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物，方便對(duì)代謝產(chǎn)物種類(lèi)和生成量進(jìn)行分析。雖然前期的體外代謝研究初步證實(shí)了CYP2A13可代謝AFB1生成包括AFB1-diol和AFM_1-diol（epoxide的水化合物形式）在內(nèi)的數(shù)十種代謝產(chǎn)物，但許多代謝產(chǎn)物尚未完全明確。同時(shí)，跟AFB1的優(yōu)勢(shì)代謝酶CYP1A2和CYP3A4相比，CYP2A13對(duì)AFB1的代謝活力強(qiáng)度還不知道，且環(huán)氧化代謝產(chǎn)物生成量不明確。 為了研究CYP2A13在體外代謝系統(tǒng)中對(duì)AFB1的代謝特征，我們首先利用第一部分建立的方法，在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中對(duì)AFB1代謝相關(guān)的CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6和CYP2A13蛋白與POR蛋白進(jìn)行了共表達(dá)；然后利用商品化的CYP1A2和CYP3A4蛋白代謝AFB1建立體外代謝孵育體系，同時(shí)建立AFB1及其產(chǎn)物AFM_1的HPLC前處理方法和檢測(cè)方法；最后利用體外表達(dá)的各種蛋白代謝AFB1，并對(duì)其代謝清除率和環(huán)氧化代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果顯示，我們建立的體外代謝孵育系統(tǒng)可成功的代謝AFB1；通過(guò)三氟乙酸衍生化和HPLC-熒光檢測(cè)器聯(lián)用可較好的用于AFB1及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)；我們體外表達(dá)的CYP1A2、CYP3A4和CYP2A13都可體外代謝清除AFB1，其中CYP2A13在60分鐘內(nèi)對(duì)5μM的AFB1清除率最高，達(dá)到了約80%；經(jīng)HPLC-Q-TOF檢測(cè)，CYP2A13可以代謝AFB1生成exo-8，9-epoxide。 因此，我們認(rèn)為CYP2A13對(duì)低劑量的AFB1清除率最高，甚至比公認(rèn)的AFB1低濃度優(yōu)勢(shì)代謝酶CYP1A2更高，其活性代謝產(chǎn)物主要為AFB1exo-8，9-epoxide。 第三部分AFB1對(duì)穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的BEAS-2B細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化效應(yīng)及其機(jī)制 流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)都證明吸入被AFB1污染的粉塵或食物攝入AFB1可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)腫瘤。在AFB1毒性發(fā)揮過(guò)程中，其代謝產(chǎn)物AFB1exo-8,9-epoxide（AFBO）與DNA分子共價(jià)結(jié)合形成AFB1-DNA，從而對(duì)DNA造成包括雙鏈斷裂在內(nèi)的損傷。這種損傷在肝臟中主要通過(guò)激活癌基因Ras，抑制抑癌基因P53表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，從而誘發(fā)肝癌。但AFB1導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)腫瘤的具體分子機(jī)制還不明確。 為了研究AFB1導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)腫瘤的具體分子機(jī)制，我們首先對(duì)穩(wěn)定表達(dá)AFB1代謝相關(guān)CYP450酶的人肺支氣管上皮細(xì)胞株（BEAS-2B）進(jìn)行單克隆挑選，構(gòu)建單克隆細(xì)胞株；然后選擇對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性的AFB1濃度對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行持續(xù)處理，構(gòu)建AFB1致穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的BEAS-2B（B-2A13）細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型；然后采用該惡性轉(zhuǎn)化模型，對(duì)AFB1致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果表明，各單克隆細(xì)胞株CYP450酶蛋白表達(dá)水平較一致；經(jīng)MTT法測(cè)定發(fā)現(xiàn)AFB1對(duì)穩(wěn)定表達(dá)不同CYP450酶的細(xì)胞株毒性不同，其中以B-2A13的敏感性最強(qiáng)，甚至比B-1A2細(xì)胞更敏感。我們選用0.1nM、1nM和10nM AFB1連續(xù)處理細(xì)胞40代，經(jīng)軟瓊脂克隆形成和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，B-2A13細(xì)胞在0.1nM處理40代時(shí)就發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化； Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)AFB1持續(xù)處理，細(xì)胞的同源重組和非同源重組相關(guān)DNA損傷修復(fù)蛋白都呈現(xiàn)高表達(dá)；而促凋亡蛋白在處理早期高表達(dá)，隨著細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化表達(dá)量降低甚至失表達(dá)；此外Raf/MEK/ERK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路中的Ras、Raf、ERK和Akt等關(guān)鍵蛋白都被激活。 因此，我們認(rèn)為低水平AFB1經(jīng)過(guò)CYP2A13代謝后生成的AFB1exo-8,9-epoxide與B-2A13細(xì)胞的DNA結(jié)合生成加合物，這種加合物可累積并導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，從而激活和招募同源重組和非同源粘性末端連接重組通路相關(guān)蛋白進(jìn)行修復(fù)；在處理早期，細(xì)胞對(duì)此類(lèi)損傷不能修復(fù)，從而誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡；但隨著原癌基因Ras、Raf、ERK的激活，細(xì)胞的增殖和抗DNA損傷能力增強(qiáng)，同時(shí)激活了Raf/MEK/ERK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路，使得細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，，最終導(dǎo)致了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。 結(jié)論 1.在Baculovirus/sf9系統(tǒng)中聯(lián)合加入0.2mM5-ALA和0.02mM Fe~(3+)，同時(shí)與POR蛋白以病毒比例為5:2（bvCYP2A13：bvPOR）共感染，最適合CYP2A13在該系統(tǒng)中的表達(dá)，可得到高表達(dá)量、有酶活性、天然不需修飾的CYP2A13蛋白。 2.采用體外CYP450酶異源表達(dá)系統(tǒng)可成功構(gòu)建AFB1的體外代謝孵育系統(tǒng)，CYP2A13在體外代謝系統(tǒng)中可成功代謝AFB1，在5μM濃度時(shí)CYP2A13對(duì)AFB1的清除率比CYP1A2還要高，其活性代謝產(chǎn)物主要為AFB1exo-8，9-epoxide。 3.0.1nM的AFB1可導(dǎo)致B-2A13細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并具有致瘤性。其機(jī)制可能與激活Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)抗凋亡能力等有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2466234