【摘要】：【研究目的】1.探索最合適的錳中毒大鼠模型建立條件,并采用判別分析方法得到通用公式,篩選造模成功的大鼠為治療對(duì)象;2.對(duì)造模成功的錳中毒大鼠進(jìn)行腦內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察移植后細(xì)胞生長(zhǎng)分化情況;3.通過(guò)檢測(cè)多巴胺含量及路易小體相關(guān)成分的改變等觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療效果。【研究方法】1.選用SPF級(jí)健康雄性SD大鼠24只,隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組(15mg/kg)、中劑量組(25mg/kg)和高劑量組(50mg/kg),腹腔注射MnCl_2·4H_2O,每48h/次,每隔一個(gè)月對(duì)所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分、肌張力改變、平衡木試驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)4項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試,待大鼠出現(xiàn)明顯行為改變時(shí)停止染毒,并檢測(cè)其大腦紋狀體酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)含量,探索最合適的造模條件(染毒劑量和時(shí)間),并以對(duì)照組大鼠TH平均水平的30%為界劃分成錳中毒組和非錳中毒組,通過(guò)4項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)聯(lián)合建立判別分析函數(shù),以便對(duì)下一步實(shí)驗(yàn)中的染毒大鼠進(jìn)行判斷。2.按上述方法的最合適造模條件對(duì)30只SD大鼠染錳,測(cè)試其行為學(xué)改變并記錄各項(xiàng)行為學(xué)評(píng)分、肌張力評(píng)分等,按照造模時(shí)得出的判別公式,對(duì)每一只染毒大鼠進(jìn)行判別。將所有符合錳中毒大鼠標(biāo)準(zhǔn)的大鼠挑選出來(lái),隨機(jī)分成空白對(duì)照組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cell,BMSCs)治療組和PBS對(duì)照組,對(duì)BMSCs治療組采用大腦立體定位法精準(zhǔn)注射BMSCs,PBS對(duì)照組注射PBS,空白對(duì)照組不做任何處理。一月后測(cè)試大鼠行為學(xué)改變,并檢測(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine,DA)含量,免疫熒光觀察移植的干細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和分化情況,western blot檢測(cè)路易小體主要成分α-syn和NF-L的含量,透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變�！狙芯拷Y(jié)果】1.造模條件探索結(jié)果:高劑量組大鼠死亡一只,采用行為學(xué)評(píng)分、肌張力評(píng)分、平衡木測(cè)試及水迷宮實(shí)驗(yàn)多項(xiàng)行為學(xué)評(píng)分來(lái)評(píng)估23只染錳大鼠的行為學(xué)改變,綜合測(cè)評(píng)大鼠的染毒效果。對(duì)照組大鼠三個(gè)月的各項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試均為陰性,低劑量組行為學(xué)雖有改變但和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的較少,高劑量組和中劑量組出現(xiàn)行為改變的時(shí)間更短并且在染毒三個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)上各項(xiàng)行為學(xué)改變差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)TH的表達(dá),高劑量組造模成功率為100%,中劑量組成功率為66.67%。由于高劑量組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)動(dòng)物死亡情況,綜合評(píng)價(jià)得出采用25mg/kgBW濃度腹腔注射MnCl_2·4H_2O三個(gè)月為最佳造模條件。2.判別分析結(jié)果:將對(duì)照組大鼠TH表達(dá)平均值作為正常水平,TH表達(dá)若低于正常水平的30%則為錳中毒模型,由此將所有大鼠分為非錳中毒組和錳中毒。兩組大鼠各項(xiàng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果,錳中毒組大鼠行為學(xué)評(píng)分均高于非錳中毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。以行為學(xué)指標(biāo)全部作為自變量,以TH作為因變量納入判別方程。Fisher判別法得到函數(shù):錳中毒大鼠:Y=-31.830+8.867x1-4.995x2+9.862x3+0.952x4+8.877x5非錳中毒大鼠:Y=-22.831+2.792x1-3.318x2+7.043x3+0.874x4+8.241x5,其中x1-x5分別代表肌張力評(píng)分結(jié)果、平衡木評(píng)分結(jié)果、行為學(xué)評(píng)分結(jié)果、水迷宮逃避潛伏期、水迷宮平臺(tái)搜索次數(shù)。將大鼠的各指標(biāo)分別帶入上述兩組函數(shù)中求出判別函數(shù)值,哪個(gè)函數(shù)值更大,則該只大鼠即屬于哪個(gè)組。符合率為為95.7%(22/23),誤判率為4.3%(1/23);該判別函數(shù)對(duì)非錳中毒大鼠和錳中毒大鼠的正確判別符合率分別是92.3%(12/13)和100%(10/10)。3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后行為學(xué)改變和理化指標(biāo)觀察:30只染錳大鼠中經(jīng)過(guò)判別公式得出19只符合錳中毒標(biāo)準(zhǔn),此次造模成功率為63.3%。移植手術(shù)后,大鼠生長(zhǎng)情況良好,無(wú)感染或其他副反應(yīng)出現(xiàn),一周左右大鼠的頭部皮膚完全愈合。治療前后三組大鼠行為學(xué)評(píng)分、肌張力評(píng)分、平衡木試驗(yàn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后三組大鼠紋狀體內(nèi)DA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.376,P=0.016),BMSCs治療組紋狀體DA含量高于對(duì)照組(P0.01)。免疫熒光可見(jiàn)兩組均有TH陽(yáng)性細(xì)胞,但BMSCs治療組TH陽(yáng)性明顯比PBS對(duì)照組多,說(shuō)明兩組都有DA神經(jīng)元存在且BMSCs治療組DA神經(jīng)元比PBS對(duì)照組多。BMSCs治療組可以看到聚集的H-Nuc表達(dá),少數(shù)開(kāi)始擴(kuò)散,并隨著腦脊液進(jìn)入各腦室,說(shuō)明外源BMSCs在大鼠大腦中可以存活至少一月,并能夠遷移至其他區(qū)域。BMSCs治療組有TH與H-Nuc雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞,PBS對(duì)照組無(wú)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞。說(shuō)明人源BMSCs移植入SD大鼠大腦后可成功分化為DA能神經(jīng)元。PBS對(duì)照組同空白對(duì)照組差異不明顯。Western blot顯示BMSCs移植治療后路易小體主要成分α-syn表達(dá)相比對(duì)照組減少而NF-L的含量增多。4.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后病理改變觀察:電鏡下,可以看到空白對(duì)照組的大鼠紋狀體內(nèi)較多神經(jīng)元周?chē)张�、核周池�(cái)U(kuò)張,核固縮、染色質(zhì)聚集,膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)聚集現(xiàn)象。說(shuō)明錳中毒大鼠紋狀體神經(jīng)元損傷和凋亡現(xiàn)象嚴(yán)重。神經(jīng)元內(nèi)還可見(jiàn)多處蛋白質(zhì)聚集且部分蛋白質(zhì)聚集物與溶酶體融合,髓鞘內(nèi)可見(jiàn)神經(jīng)絲異常。BMSCs治療組可見(jiàn)較多紋狀體神經(jīng)元核膜呈圓形或橢圓形,具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。高線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、等細(xì)胞器豐富清晰,線粒體結(jié)構(gòu)完整清晰,路易小體的蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象較少,髓鞘內(nèi)神經(jīng)絲無(wú)聚集、線粒體形態(tài)正常�！狙芯拷Y(jié)論】1.25mg/kgBW MnCl_2·4H_2O染毒三個(gè)月可建立較好的錳中毒模型,通過(guò)幾項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試組合得出的判別公式可篩選出錳中毒大鼠。2.BMSCs腦內(nèi)移植損傷較小,移植的干細(xì)胞生長(zhǎng)分化情況較好。3.BMSCs移植后DA含量增高,路易小體聚集減少,DA神經(jīng)元損傷改善明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R135.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2437161