【摘要】：目的：過氧化苯甲酰（benzoyl peroxide,BPO）是我國自上世紀(jì)80年代以來普遍添加于面粉中的一種漂白劑，它具有增白面粉、加速面粉后熟、抑制面粉霉變、提高出粉率等作用。近年來，人們愈發(fā)關(guān)注它作為食品添加劑產(chǎn)生的安全隱患問題，使其應(yīng)用備受爭議。我國于2011年5月起禁止使用過氧化苯甲酰作為食品添加劑。而在世界范圍內(nèi)，仍有多個國家繼續(xù)使用過氧化苯甲酰作為食品添加劑，且添加量參差。 目前有研究表明外用BPO作為治療痤瘡的藥物成分存在致癌可能，但攝入BPO具體對人類健康存在哪些影響及危害，仍無定論。因有報道BPO加熱時可分解產(chǎn)生苯自由基，受此啟發(fā)，擬探討B(tài)PO產(chǎn)生的活性氧對HepG2細胞是否具有遺傳毒性，并進一步研究其機制。我們選用的HepG2細胞是來源于人類的肝癌細胞系，它保留了人類正常肝實質(zhì)細胞的許多功能，有較完整的生物轉(zhuǎn)化代謝酶活性，被認為是檢測外來化合物遺傳毒性的理想細胞系。 本實驗研究選用HepG2細胞，檢測BPO的遺傳毒性及其氧化應(yīng)激及溶酶體、線粒體途徑的毒理學(xué)機制，旨在為攝入BPO引發(fā)的人類健康安全隱患提供試驗及理論依據(jù)。 方法：以HepG2細胞作為檢測系統(tǒng)。用單細胞凝膠電泳（SGCE）來檢測DNA鏈的斷裂，用蛋白質(zhì)印跡法（western blot）來檢測損傷蛋白P53的生成。為了闡明BPO對HepG2細胞的遺傳毒性機制，用2’,7’—二氫二氯熒光素（DCFH）來測定細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，通過N-乙酰半胱氨酸（NAC）干預(yù)試驗減少ROS生成來探討氧化性損傷氧化應(yīng)激在對DNA損傷中發(fā)揮的作用；分別以吖啶橙（AO）和羅丹明123（Rhodamine123）為探針來測定細胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性和線粒體膜電位的改變水平，通過氯化銨（NH4Cl，溶酶體膜保護劑）、地昔帕明(desipramine，酸性神經(jīng)鞘磷脂酶的抑制劑)進行干預(yù)來探討溶酶體膜穩(wěn)定性與DNA損傷的關(guān)系。此外，分別用NAC、NH4Cl和地西帕明干預(yù)單細胞凝膠電泳實驗與蛋白質(zhì)印跡實驗，以更好的驗證試驗機制。試驗結(jié)果用SPSS v11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：25-100μMBPO與HepG2細胞接觸1h后，細胞內(nèi)DNA鏈發(fā)生斷裂，熒光顯微鏡下觀察到細胞呈彗星樣拖尾，其尾長和尾DNA含量隨藥物濃度增加而明顯增加，呈劑量依賴效應(yīng)，用NAC、NH4Cl、地西帕明進行干預(yù)后，尾長和尾DNA含量明顯減少。25-100μMBPO與HepG2細胞接觸24h后，檢測到P53表達明顯增多，呈劑量依賴效應(yīng)，用NAC、氯化銨、地西帕明干預(yù)后，P53表達明顯減少。25-100μMBPO作用于HepG2細胞1h后，引起細胞內(nèi)ROS水平的增高，與對照組相比其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,用NAC干預(yù)后，ROS水平明顯下降。25-100μMBPO與HepG2細胞接觸1h后，溶酶體膜穩(wěn)定性下降，呈劑量依賴效應(yīng)，用NAC、氯化銨干預(yù)后，溶酶體膜穩(wěn)定性得到一定保護。25-100μMBPO與HepG2細胞反應(yīng)一小時，可使HepG2細胞線粒體膜電位下降，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：BPO(25-100μM)可以導(dǎo)致HepG2細胞DNA損傷，對HepG2細胞具有遺傳毒性。同時，研究還表明BPO（25-100μM）可以導(dǎo)致HepG2細胞內(nèi)ROS水平增高，，且用抗氧化劑NAC干預(yù)后ROS水平明顯降低，同時DNA鏈斷裂程度減弱，損傷蛋白P53表達減少，表明該DNA損傷可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。BPO(25-100μM)可導(dǎo)致HepG2細胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性降低，氯化銨與地西帕明的干預(yù)使HepG2細胞溶酶體膜穩(wěn)定性升高，且能減弱DNA鏈斷裂的程度，減少P53的表達，表明BPO所致HepG2細胞遺傳毒性也與溶酶體途徑有關(guān)。BPO（25-100μM）同樣可使HepG2細胞線粒體膜電位下降，一定程度上表明線粒體途徑也是該遺傳毒性的可能機制之一。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2428055