【摘要】：背景鉛是一種廣泛分布的環(huán)境污染物。鉛暴露可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列中樞神經(jīng)毒性效應(yīng),包括智商的降低、認(rèn)知缺陷、注意力渙散以及攻擊行為的增加等。發(fā)育期的大腦屏障是鉛神經(jīng)毒性的重要靶點(diǎn)之一,主要包括血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)和血腦脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB)。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接(tight junction,TJ)、星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足、基膜和周細(xì)胞是BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的TJ構(gòu)成了BCB。以往研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露可以引起B(yǎng)BB和BCB緊密連接蛋白(tight junction proteins,TJPs)表達(dá)水平下降,導(dǎo)致TJ結(jié)構(gòu)的破壞和屏障通透性的增高。然而,鉛暴露導(dǎo)致TJPs水平降低的機(jī)制目前尚不清楚。鉛進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)或者腦脊液的途徑尚未完全揭示,已知鉛入腦的主要途徑有兩種:一是破壞TJ后從細(xì)胞間的區(qū)域穿過,二是通過大腦屏障細(xì)胞上的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)通道攝入。Connexin 43(Cx43)是BBB和BCB中表達(dá)最為廣泛的縫隙連接(gap junction,GJ)分子,Cx43半孔道近來被發(fā)現(xiàn)是多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)孔道。既往文獻(xiàn)顯示,鉛暴露可引起海馬腦區(qū)Cx43的表達(dá)增高,而海馬是腦內(nèi)鉛蓄積的重要部位,提示Cx43半孔道可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)鉛的功能。Src是非受體型蛋白酪氨酸激酶,可在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)界面的粘著復(fù)合體上介導(dǎo)整合素的信號(hào)。Src激酶的活性對(duì)于上皮細(xì)胞TJPs的組裝和降解都至關(guān)重要。而且,Src還可直接與Cx43相互作用,并通過磷酸化Cx43來降低GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊(GJ-mediated intercellular communication,GJIC)、引起GJ的降解和孔道的關(guān)閉。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn):鉛暴露大鼠大腦微血管組織中Src磷酸化顯著上調(diào),且增高幅度高于其他蛋白激酶。目的本課題的研究目的在于明確:(1)鉛暴露是否通過Src激酶途徑改變BBB與BCB的TJ蛋白的表達(dá);(2)Cx43在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中攝取鉛的作用;(3)Src磷酸化是否參與調(diào)控Cx43的表達(dá)及細(xì)胞的鉛蓄積。方法1.以大鼠大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(RBE4)和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞系(Z310)作為研究對(duì)象,分別建立BBB和BCB的體外模型。采用原子吸收分光光度法檢測細(xì)胞鉛吸收量。2.Western blot法檢測細(xì)胞P-Src、C-Src、GRP78、Cx43等蛋白表達(dá)水平的變化。q RT-PCR技術(shù)檢測GRP78、Cx43等分子的m RNA水平。3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測GRP78、Cx43在細(xì)胞中的分布,免疫電鏡、生物素標(biāo)記活細(xì)胞膜蛋白等技術(shù)檢測RBE4細(xì)胞中GRP78定位和分布的變化。4.采用溴化乙錠(Eth Br)攝取實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞Cx43半孔道的吸收功能。5.采用si RNA干涉技術(shù)抑制GRP78的表達(dá)水平,觀察其對(duì)Src、occludin和ZO-1等蛋白表達(dá)的影響。使用Src信號(hào)通路阻斷劑,檢測抑制Src磷酸化對(duì)GRP78、Cx43、occludin和ZO-1等蛋白表達(dá)的影響。6.基于Z310細(xì)胞構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系i ZCx43,實(shí)現(xiàn)可控的四環(huán)素誘導(dǎo)Cx43高表達(dá),原子吸收分光光度法檢測Cx43表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞鉛吸收的影響。結(jié)果1.鉛處理RBE4和Z310細(xì)胞24 h后,Src的磷酸化均顯著增加,但是其上游分子GRP78僅在RBE4細(xì)胞中出現(xiàn)上調(diào)。阻斷Src的磷酸化可逆轉(zhuǎn)鉛暴露所引起occludin水平的降低,但對(duì)ZO-1則無此作用。2.在RBE4細(xì)胞中,GRP78 si RNA干涉可減弱鉛所誘導(dǎo)的Src磷酸化和occludin水平的降低。免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)鉛暴露能夠引起GRP78蛋白的分布范圍從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜擴(kuò)散。中和抗體封閉膜表面GRP78未能引起Src磷酸化的逆轉(zhuǎn),提示細(xì)胞質(zhì)GRP78,而非膜表面GRP78,參與鉛激活Src磷酸化及隨后occludin水平的降低。3.鉛暴露可上調(diào)RBE4細(xì)胞Cx43的蛋白水平,下調(diào)Z310細(xì)胞Cx43的蛋白水平,而RBE4細(xì)胞蓄積鉛的能力高于Z310細(xì)胞,說明Cx43的上調(diào)能增加RBE4細(xì)胞的鉛吸收量,而它的下調(diào)則限制Z310細(xì)胞的鉛吸收。降低培養(yǎng)基中的血清濃度可誘導(dǎo)Cx43半孔道開放,同時(shí)細(xì)胞的鉛吸收也顯著增加。Cx43介導(dǎo)的鉛吸收可被Cx43的半孔道抑制劑顯著阻斷。瞬時(shí)過表達(dá)Cx43可引起細(xì)胞鉛吸收量的增加。以四環(huán)素誘導(dǎo)i ZCx43細(xì)胞Cx43表達(dá)增高后,細(xì)胞的鉛吸收量也顯著增加。4.在RBE4細(xì)胞中,Src通路的激活參與鉛暴露致Cx43的上調(diào),提示鉛暴露可能通過促進(jìn)Src磷酸化而增加細(xì)胞的鉛吸收;而在Z310細(xì)胞中,鉛暴露可誘導(dǎo)Src通路激活,但同時(shí)Cx43蛋白水平和細(xì)胞鉛吸收量下降,提示在Z310細(xì)胞中除Cx43外,還可能存在其他受Src調(diào)控的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子。結(jié)論在大腦屏障細(xì)胞中,鉛暴露可通過促進(jìn)Src激酶的磷酸化,從而引起occludin蛋白水平的降低和屏障通透性的破壞;同時(shí),Src激酶的磷酸化還能夠調(diào)節(jié)大腦屏障細(xì)胞Cx43蛋白的表達(dá),從而影響細(xì)胞膜表面Cx43半孔道對(duì)鉛的吸收。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R114
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本文編號(hào)：2426426