【摘要】：背景 電離輻射誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生急、慢性炎性反應(yīng),進(jìn)而破壞機(jī)體免疫平衡,并表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞中各細(xì)胞亞群的比例失衡,Treg細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞的重要免疫調(diào)節(jié)亞群,在輻射照射后細(xì)胞數(shù)目、比例及表型的改變將直接影響機(jī)體免疫平衡,為此近年來已有學(xué)者對Treg細(xì)胞輻射敏感性方面開展了初步研究,但隨著對Treg細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入,明確了許多與Treg細(xì)胞表型和功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子與表面分子,而這些分子的差異表達(dá)往往與炎性反應(yīng)類型和所在的器官不同而不同,其中哪些因子在輻射誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用尚未見相關(guān)研究報(bào)道。 目的 分析不同劑量丫射線照射對淋巴細(xì)胞及其Treg亞群細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞比例的影響,并在此基礎(chǔ)上明確2Gyγ射線照射對Treg細(xì)胞凋亡率、增殖能力及Treg細(xì)胞表型的影響,進(jìn)而分析Treg細(xì)胞凋亡與表型改變之間的關(guān)系和靶向作用于差別表達(dá)表型因子的microRNA的表達(dá)變化,探討表型改變及其潛在作用的基因水平調(diào)控機(jī)制,為輻射誘導(dǎo)免疫失衡的預(yù)防與恢復(fù)治療提供理論依據(jù)。 方法 1.利用不同劑量(0.25Gy,0.5Gy,0.75Gy,1Gy,2Gy和5Gy)60Coy射線全身照射小鼠,分離胸腺和脾臟中的淋巴細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù),再利用FACS檢測Treg細(xì)胞亞群的比例變化； 2.2Gy γ射線照射離體小鼠胸腺淋巴細(xì)胞,在照后9h利用FACS檢測Treg細(xì)胞及Tcon細(xì)胞中7-AAD的結(jié)合水平； 3.2Gy γ射線全身照射小鼠,在照后1、4和10d分離胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞,利用FACS檢測Treg細(xì)胞及Tcon細(xì)胞Annexin-V和Ki-67的表達(dá),檢測Treg細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的表達(dá),檢測Treg細(xì)胞表型因子CD39、CD103等的表達(dá),檢測nTreg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Helios的表達(dá),檢測凋亡相關(guān)因子Bcl-2、 Bax的表達(dá)； 4.檢索靶向作用于CD39的microRNAs,并利用real-time PCR對檢索到的microRNAs進(jìn)行擴(kuò)增分析,擴(kuò)增底物為從分選的CD4+T細(xì)胞中提取的RNA； 5.分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞,利用ATP檢測試劑盒檢測Treg細(xì)胞內(nèi)ATP水平。 結(jié)果 1.小鼠受照后胸腺細(xì)胞和脾臟細(xì)胞呈劑量依賴性減少,在照后4d降至最低(F=118.08、144.01,p0.05)。較高劑量(1-5Gy)照射后,胸腺中Treg細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間逐漸減少,而脾臟中該細(xì)胞亞群逐漸恢復(fù)；而較低劑量照射后胸腺中Treg細(xì)胞數(shù)有所增加。與0Gy組相比較,Treg細(xì)胞比例隨劑量增加而增加(F胸腺=5.16、89.44、3.01,p0.05；F脾臟=52.02、32.13、27.45,p0.05)； 2.離體Treg細(xì)胞自然存活率低于Tcon細(xì)胞,2Gy γ射線照射后,二者存活率均減小,后者減小幅度顯著(t=-14.03,p0.05)； 3.全身受照后4d, Treg細(xì)胞凋亡率顯著增加,且高于Tcon細(xì)胞；不同器官中Treg細(xì)胞凋亡率和增殖水平改變不同,一方面胸腺Treg細(xì)胞凋亡率低于脾臟,另一方面胸腺中Ki-67+Treg細(xì)胞比例在受照后1d先減小,至照后4d又增加,而脾臟中該比例先增加,至照后4d相對對照組有所恢復(fù)； 4.受照后FOXP3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例增加,單個(gè)細(xì)胞中FOXP3的MFI變化在胸腺中下調(diào),在脾臟中上調(diào),但均在受照后10d改變最為顯著(t=3.22,-5.34；p0.05)；而Helios的表達(dá)相對穩(wěn)定,胸腺與脾臟中的變化規(guī)律基本一致； 5.受照后Treg細(xì)胞中CD39和CD103的表達(dá)具有顯著差異,其中CD39+Treg細(xì)胞比例增加,單個(gè)Treg細(xì)胞中CD39的MFI在胸腺中上調(diào)而在脾臟中下調(diào)；CD103+Treg細(xì)胞比例變化在脾臟中先下調(diào)后上調(diào),在胸腺中于受照后4d出現(xiàn)一過性上調(diào),單個(gè)Treg細(xì)胞CD103的MFI在胸腺中下調(diào),而在脾臟中上調(diào)； 6.胸腺Treg細(xì)胞中Bcl-2的MFI變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Bax的MFI呈上調(diào)趨勢,Bax/Bcl-2比值亦上調(diào)(t=-3.43,p0.05)；脾臟中的變化規(guī)律相反,Bcl-2的MFI持續(xù)上調(diào),而Bax的MFI變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Bax/Bcl-2比值下調(diào)t=2.40,p0.05)；單個(gè)Treg細(xì)胞中CD39的MFI變化規(guī)律與Bax/Bcl-2比值變化規(guī)律一致； 7.利用microRNA數(shù)據(jù)庫檢索了靶向作用于CD39的microRNAs,檢索結(jié)果有6個(gè),然后利用real-time PCR進(jìn)行擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)miR-31的表達(dá)變化與CD39的MFI變化規(guī)律基本一致。 結(jié)論 1.不同劑量照射對淋巴細(xì)胞及其Treg細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)的影響不同,其中較高劑量誘導(dǎo)Treg細(xì)胞數(shù)減少,而低劑量照射誘導(dǎo)其增加；淋巴細(xì)胞與Treg細(xì)胞亞群之間具有不同的時(shí)間響應(yīng)； 2.離體Treg細(xì)胞對輻射具有抗性,但輻射可誘導(dǎo)全身照射的Treg細(xì)胞凋亡率顯著增加,且輻射誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡率與增殖能力的改變隨受照后時(shí)間和所處器官的不同而具有不同規(guī)律,表明Treg細(xì)胞的活性受所處微環(huán)境的影響顯著。 3.Bax和Bcl-2分別在胸腺和脾臟的輻射誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮主要作用,Bax/Bcl-2比值的改變可以反映Treg細(xì)胞的凋亡水平,且Bax和Bcl-2參與的Treg細(xì)胞凋亡機(jī)制中受CD39的正向調(diào)節(jié)； 4.輻射可誘導(dǎo)FOXP3的表達(dá)改變,Treg細(xì)胞具有可塑性；同時(shí)輻射可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞表型改變,其中CD39和CD103是輻射誘導(dǎo)Treg細(xì)胞表達(dá)差異的兩個(gè)重要表面因子, CD103介導(dǎo)輻射誘導(dǎo)炎性反應(yīng)中Treg細(xì)胞的遷移,而CD39的表達(dá)差異則主要參與Treg細(xì)胞的抗輻射誘導(dǎo)凋亡； 5.CD39的表達(dá)水平變化受外在微環(huán)境的影響,也有基因水平的調(diào)節(jié),其中miR-31對其發(fā)揮負(fù)向靶向調(diào)節(jié)作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孟凡旭;單玉興;董娟聰;金順子;;不同劑量電離輻射對小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及TGF-β1表達(dá)的影響[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

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本文編號：2413383