【摘要】：職業(yè)性三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)接觸引起的藥疹樣皮炎已成為嚴重危害接觸工人健康的職業(yè)衛(wèi)生問題。目前,根據(jù)其臨床癥狀和流行病學(xué)研究普遍認為其發(fā)病機制可能是以細胞免疫為主的Ⅳ型超敏反應(yīng)。但是,由于超敏反應(yīng)發(fā)生機制的復(fù)雜性,TCE藥疹樣皮炎的具體發(fā)病機制尚未完全闡明。同時缺乏適當(dāng)?shù)牡膭游锬Ｐ鸵呀?jīng)嚴重限制了其發(fā)病機制的研究。細胞因子在超敏反應(yīng)的誘導(dǎo)、T細胞增殖分化以及效應(yīng)階段均發(fā)揮著重要作用,關(guān)于細胞因子的研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物誘發(fā)的超敏反應(yīng),并將細胞因子的表達水平作為疾病發(fā)生嚴重程度及疾病病程進展的效應(yīng)標(biāo)志物。因此,本研究首先從細胞因子的角度探討了TCE本身及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物在TCE藥疹樣皮炎發(fā)病過程中的作用；根據(jù)課題組前期人群病例-對照研究中發(fā)現(xiàn)的HLA-B*1301這一易感基因,進一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的基因?qū)胄∈蟛L試建立TCE藥疹樣皮炎的疾病動物模型,以細胞因子表達變化、T細胞活化、增殖及皮膚、肝臟組織病理變化等指標(biāo)作為疾病模型構(gòu)建成功的標(biāo)志并探討HLA-B*1301基因在發(fā)病過程中的功能,以期為研究TCE藥疹樣皮炎發(fā)病機制提供線索。 1.三氯乙烯誘導(dǎo)細胞因子表達變化及其調(diào)控機制 結(jié)合人群和體外細胞研究,利用液態(tài)懸浮芯片和ELISA的方法分別檢測了IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α在人群外周血血清和HaCaT細胞培養(yǎng)上清的表達水平；免疫印跡法檢測NF-κB信號通路中p65和IκBα在細胞總蛋白中的表達及其磷酸化水平以及p65細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的蛋白量；ELISA檢測細胞核內(nèi)p65與DNA的結(jié)合活力；利用NF-κB通路的化學(xué)抑制劑Bay11-7082證明NF-κB信號通路與細胞因子表達之間的關(guān)聯(lián)。 結(jié)果顯示：1)比較TCE藥疹樣皮炎病人、TCE暴露工人和TCE非暴露工人外周血血清中前炎性因子的表達水平,發(fā)現(xiàn)病例組血清中IL-1β(p=0.033, p=0.015)、IL-6(p0.001).IL-8(p0.001,p=0.002)和]NF-α(p=0.009,p=0.005)的水平顯著高于其它兩組,而在TCE暴露組和非暴露組間無顯著性差異。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)這四種細胞因子表達水平間存在正相關(guān),未發(fā)現(xiàn)其與疾病的發(fā)病時間之間有相關(guān)性。2)以HaCaT細胞為模型,用TCE主要的體內(nèi)代謝產(chǎn)物TCOH和TCA處理細胞后,發(fā)現(xiàn)TCOH夠以劑量-效應(yīng)的方式增加HaCaT細胞IL-1a和IL-6的表達水平以及以劑量、時間-效應(yīng)的方式激活NF-κB信號通路,未發(fā)現(xiàn)TCA有類似作用。以Bay11-7082抑制NF-κB通路后,IL-6的表達被抑制而IL-1α表達未受影響。 2.人類HLA-B*1301/p2M雙轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及TCE藥疹樣皮炎轉(zhuǎn)基因小鼠模型的探討 分別將人HLA-B*1301基因和β2M基因cDNA克隆至pUbC真核表達載體,成功構(gòu)建pUbC-B1301和pUbC-β2M重組質(zhì)粒。采用顯微注射的方式將線性化的重組質(zhì)粒導(dǎo)入C57BL/6小鼠受精卵中,并隨機整合到小鼠基因組中。對出生后的小鼠進行PCR鑒定,選擇攜帶目的基因的小鼠進行繁育F1、F2代并篩選出攜帶目的基因的子代小鼠進行mRNA表達的鑒定,篩選出了mRNA高表達并穩(wěn)定遺傳的首建鼠各三個品系進行繁育,擴大種群數(shù)量。進一步取首建鼠進行兩兩雜交,采用流式檢測的方法,篩選出HLA-B*1301蛋白高表達的HLA-B*1301/β2M雙基因小鼠并進行批量繁殖。以野生C57BL/6小鼠和HLA-B*1301/β2M雙轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠為模型鼠,應(yīng)用腹腔注射聯(lián)合皮膚涂抹的體內(nèi)染毒方式,比較兩種小鼠在染毒1周和2周后的免疫學(xué)效應(yīng)的變化,所選效應(yīng)指標(biāo)包括：細胞因子表達、T細胞增殖、體內(nèi)外T細胞活化和皮膚、肝臟組織病理。 結(jié)果顯示： 1)小鼠連續(xù)體內(nèi)染毒1周后,分離外周血血清并檢測IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF和IL-1p的表達水平,無論野生小鼠還是轉(zhuǎn)基因小鼠,染毒組血清IL-6水平均高于未染毒組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而血清IFN-γ、IL-4、TNF和IL-1p水平在兩組之間均未見顯著性差異。小鼠連續(xù)體內(nèi)染毒2周后,野生小鼠染毒組與未染毒組相比較,血清IL-6水平仍高于未染毒組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而轉(zhuǎn)基因小鼠染毒組血清IL-6水平降低,與未染毒組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。未發(fā)現(xiàn)血清IFN-γ、IL-4、TNF和IL-1p水平在兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2)小鼠連續(xù)體內(nèi)染毒1周后,分離脾細胞體外培養(yǎng)并分別以O(shè).1mMTCE、0.2mMTCOH,5μg/ml ConA處理48小時后,以CCK-8法檢測T細胞增殖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生鼠脾細胞體外ConA處理后T細胞明顯增殖,但染毒組和對照組小鼠T細胞增殖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾細胞體外ConA處理后T細胞增殖水平在染毒組和對照組小鼠間存在差異,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。同時還發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾細胞體外TCOH處理后T細胞增殖水平也顯著增加(p0.05)。以EdU摻入法來檢測T細胞增殖,不論野生鼠還是雙轉(zhuǎn)基因鼠,脾細胞體外ConA刺激后T細胞增殖量在染毒組和非染毒組小鼠間均存在差異,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。未發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾細胞體外TCOH處理后T細胞增殖量在染毒組和對照組小鼠間存在差異。小鼠連續(xù)體內(nèi)染毒2周后,以CCK-8法檢測T細胞增殖,無論是野生鼠還是雙轉(zhuǎn)基因鼠,脾細胞體外ConA處理后T細胞增殖在染毒組和對照組小鼠間均無顯著性差異。EdU摻入法檢測發(fā)現(xiàn)染毒組小鼠脾細胞體外ConA處理后T細胞增殖量均比對照組小鼠下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 3)比較兩種小鼠在體內(nèi)連續(xù)染毒1周后的淋巴結(jié)細胞與脾細胞的活化程度,結(jié)果表明：無論是野生鼠還是雙轉(zhuǎn)基因鼠,染毒組小鼠體內(nèi)CD3+、CD3+CD4+、 CD3+CD8+、CD3+CD25+及CD3+CD69+細胞比例與對照組比較均無顯著性差異。體內(nèi)連續(xù)染毒2周后分離小鼠脾細胞和淋巴結(jié)細胞體外培養(yǎng)并分別以0.1mMTCE、0.2mMTCOH,5μg/ml ConA處理48小時后,流式細胞儀檢測T細胞活化,發(fā)現(xiàn)野生小鼠染毒組淋巴結(jié)CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞比例與對照組比較均降低,其中ConA處理后淋巴結(jié)CD3+細胞的下降具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；雙轉(zhuǎn)基因小鼠染毒組淋巴結(jié)CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞比例均比對照組顯著下降(p0.01),并且ConA處理后染毒組淋巴結(jié)CD3+CD25+及CD3+CD69+細胞比對照組也顯著下降(p0.05)。未發(fā)現(xiàn)兩種小鼠脾細胞體外活化程度有顯著性差異。 4)肝臟和背部皮膚組織HE染色結(jié)果表明：體內(nèi)連續(xù)染毒2周后,野生小鼠染毒組4只小鼠中有1只背部皮膚組織出現(xiàn)較明顯炎細胞浸潤,染毒組肝臟組織及對照組皮膚、肝臟組織均無病理變化。轉(zhuǎn)基因小鼠染毒組4只小鼠中有1只背部皮膚組織出現(xiàn)較嚴重炎細胞浸潤同時伴有肝細胞水腫等病理變化,對照組皮膚及肝臟組織均無病理變化。 綜上所述,1)本研究結(jié)果提示TCOH主要通過激活HaCaT細胞NF+κB通路來增加IL-6的表達水平,并且TCOH在TCE藥疹樣皮炎發(fā)病中發(fā)揮著主要作用。IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α四種細胞因子可能參與了TCE藥疹樣皮炎的發(fā)病過程,其表達水平可以作為TCE藥疹樣皮炎動物模型構(gòu)建成功的效應(yīng)標(biāo)志之 。2)通過比較野生小鼠和雙轉(zhuǎn)基因小鼠在體內(nèi)TCE染毒后各效應(yīng)指標(biāo)的變化,發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠比較,TCE增強了小鼠機體的免疫功能；與野生小鼠比較,HLA-B*1301/β2M雙轉(zhuǎn)基因小鼠對TCE的免疫毒性作用更敏感；兩種小鼠在體內(nèi)連續(xù)TCE染毒后,機體免疫功能均呈現(xiàn)先增強后抑制的現(xiàn)象。雖然本次研究尚未建立起理想的TCE藥疹樣皮炎動物模型,但是本研究結(jié)果為今后的進一步完善和改進提供了重要基礎(chǔ),為疾病動物模型的成功建立提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R135.7

【參考文獻】

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