【摘要】：研究目的 百草枯(paraquat, PQ),又名對草快、克蕪蹤等,由于其除草效果好,對環(huán)境污染小,被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用。隨著百草枯的廣泛使用,近年來由百草枯引起的中毒病例不斷增多。百草枯對人的毒性極大,肺組織是其作用的主要靶器官,目前臨床上尚無特效藥物治療,中毒死亡率可達(dá)50-90%。雖然近年來對百草枯的中毒機(jī)制進(jìn)行了大量研究,但目前尚未完全闡明。因而研究百草枯致機(jī)體損傷的機(jī)制,對于有效的預(yù)防和治療百草枯中毒具有重要的現(xiàn)實意義。 二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是n-3系列多不飽和脂肪酸(n-3polyunsaturated fatty acids, n-3PUFA),主要是從魚油或者微藻油中提煉的。早期的研究表明,DHA對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要作用,并對心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化等起到較好的治療效果。新近的研究顯示,DHA具有明顯的抗炎抗氧化作用,并在一定程度上減輕人類的一些纖維病變。早期的急性炎癥和后期的肺纖維化是百草枯中毒死亡的主要原因,因此我們推測DHA可能具有拮抗百草枯誘導(dǎo)的肺損傷的作用。 為研究DHA對百草枯中毒的拮抗作用,本研究采用一次性經(jīng)口給予雄性昆明小鼠50mg/kg.bw PQ建立急性肺損傷模型,從動物死亡情況、氧化抗氧化系統(tǒng)等方面觀察DHA拮抗百草枯引起的急性肺損傷的作用；采用一次性經(jīng)口給予雄性wistar大鼠50mg/kg.bw PQ染毒,建立百草枯肺纖維化模型,通過測定肺組織中膠原纖維蛋白含量及肺組織病理改變,觀察DHA對百草枯引起的肺纖維化的拮抗作用,通過檢測肺組織纖維化過程中的兩個重要調(diào)控因子Smad7、SnoN的蛋白水平的變化初步探討百草枯引起肺纖維化的中毒機(jī)制。 研究方法 1.急性肺損傷模型的建立及指標(biāo)測定 SPF級雄性昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后,隨機(jī)分為正常對照組、模型組和DHA干預(yù)組,每組24只。DHA干預(yù)組動物每天經(jīng)灌胃給予500mg/kg.bw的DHA；正常對照組、模型組動物每天給予等體積的玉米油灌胃。在給予DHA的第8天,PQ經(jīng)生理鹽水稀釋后,模型組和DHA干預(yù)組動物經(jīng)灌胃一次性給予50mg/kg.bw PQ染毒,正常對照組給予等體積生理鹽水。PQ染毒后,持續(xù)給予DHA,觀察記錄各組動物死亡情況,于染毒7天后20%烏拉坦腹腔注射麻醉動物,取肺組織進(jìn)行各指標(biāo)測定。 觀察PQ染毒后各組小鼠的死亡情況,比較各組小鼠的肺臟系數(shù),采用生化法測定小鼠肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、還原性谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量；Western blotting測定小鼠肺組織中4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal,4-HNE)和MDA蛋白加合物水平的變化。 2.肺纖維化模型的建立及指標(biāo)測定 SPF級雄性Wistar大鼠,體重200-220g,適應(yīng)性飼養(yǎng)5天,隨機(jī)分為正常對照組、模型組、DHA干預(yù)組和DHA對照組,每組10只。DHA干預(yù)組和DHA對照組每天一次分別給予500mg/kw.bw的DHA灌胃,正常對照組、模型組給予等體積玉米油。給予DHA的第8天,PQ用生理鹽水稀釋后,經(jīng)灌胃分別給予模型組、DHA干預(yù)組動物50mg/kg.bw的PQ一次性染毒,等體積生理鹽水分別給予正常對照組和DHA對照組。PQ染毒后,各組動物持續(xù)給予DHA,于染毒后第35天,處死動物。 蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察肺組織病理學(xué)改變,Masson染色法、濕重/干重比值(wet-to-dry weight ratio, W/D)觀察肺組織纖維化程度；肺組織中羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量采用堿水解法測定；采用SABC免疫組織化學(xué)法、Western blotting測定大鼠肺組織中Smad7、SnoN蛋白水平的變化。 研究結(jié)果 1.DHA對百草枯誘導(dǎo)急性肺損傷的拮抗作用 1.1DHA對PQ誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷致死亡的影響 模型組和DHA干預(yù)組經(jīng)灌胃一次性給予PQ7天后,模型組小鼠死亡率為58.3%,DHA干預(yù)組小鼠死亡率為33.3%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),說明DHA能顯著降低PQ誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷導(dǎo)致的死亡 1.2DHA對PQ誘導(dǎo)小鼠肺臟器系數(shù)的影響 PQ染毒7天后,肉眼解剖觀察,正常對照組小鼠肺組織呈粉紅色,無充血、水腫現(xiàn)象；模型組動物肺組織表面色澤暗紅,充血、水腫明顯,體積明顯增大,包膜下可見點狀、片狀出血,切面疏松,有淡紅色液體溢出；DHA干預(yù)組動物肺組織較模型組動物損傷明顯減輕,輕度充血、水腫,有散在包膜下出血。正常對照組肺臟器系數(shù)為(0.574±0.085)%,PQ誘導(dǎo)肺損傷后,模型組的肺臟器系數(shù)為(1.021±0.683)%,DHA干預(yù)組為(0.710±0.20)%,與正常對照組相比,模型組肺臟器系數(shù)增加了77.87%(P0.01)；提前1周給予DHA干預(yù),可明顯降低PQ誘導(dǎo)的肺充血水腫和炎性變化,與模型組相比,兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 1.3DHA對PQ誘導(dǎo)急性肺損傷肺組織中MPP、MDA及GSH含量的影響 與正常對照組相比,模型組動物肺組織中的MPO含量增加了20.6%(P0.01)；DHA干預(yù)組肺組織中的MPO含量明顯低于模型組(P0.05),與正常對照組無明顯差別。 模型組小鼠給予PQ后肺組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯增強(qiáng)。與正常對照組相比,模型組肺組織中MDA含量增加了21.7%(P0.01)；DHA干預(yù)組比模型組減少了14.4%(P0.01),說明提前給予7天DHA能夠有效抑制肺組織中MDA水平的增加(P0.01) PQ攝入7天后,與正常對照組相比,模型組動物肺組織中GSH水平下降了14.2%(P0.01),與模型組相比,DHA干預(yù)組GSH水平顯著增加(P0.05),與正常對照組差別不明顯(P0.05)。 1.4DHA對PQ誘導(dǎo)急性肺損傷肺組織中4-HNE、MDA蛋白加合物水平的影響 Western blotting的結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型組小鼠肺組織中4-HNE蛋白加合物表達(dá)水平增加了43.97%(P0.05),而提前給予DHA干預(yù)后,小鼠肺組織中的4-HNE蛋白加合物表達(dá)水平僅增加了3.16%,比模型組顯著減少(P0.05)；與正常對照組比較,模型組小鼠肺組織中MDA蛋白加合物表達(dá)水平增加了42.39%(P0.05),提前給予DHA干預(yù)后,小鼠肺組織中的MDA蛋白加合物表達(dá)水平增加了16.97%,DHA對照組與正常對照組均無明顯差別(P0.05)。說明提前給予DHA干預(yù)能夠有效降低PQ引起的肺組織的氧化應(yīng)激。 2.DHA對百草枯引起的肺纖維化的拮抗作用 2.1動物體重及一般情況觀察 模型組動物給予PQ染毒后,皮毛蓬松,毛色暗淡,精神萎靡,進(jìn)食、進(jìn)水量減少,行動遲緩。染毒后體重增長減慢,28天后體重明顯低于正常對照組(P0.05),DHA干預(yù)組、DHA對照組體重與正常對照組無明顯差別。 2.2肺組織HE染色 各組動物肺組織經(jīng)HE染色后,光鏡下觀察可見,正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰,壁薄,肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺組織間隔增厚變寬,肺泡腔明顯狹窄,伴局灶性肺不張；DHA干預(yù)組動物肺泡壁無明顯增厚,結(jié)構(gòu)清晰,病變不明顯；DHA對照組與正常對照組無明顯差別。 2.3肺組織纖維化改變 2.3.1W/D比值 PQ模型組的W/D明顯小于正常對照組(P0.05),與模型組相比,DHA干預(yù)組與DHA對照組W/D均顯著增大(P0.05),與正常對照組無顯著差別。 2.3.2肺組織中羥脯氨酸含量 PQ染毒35天后,與正常對照組相比,模型組肺組織中的羥脯氨酸含量增加了18.3%(P0.05)；DHA干預(yù)組及DHA對照組的含量與正常對照組差別不明顯,但明顯低于模型組(P0.05)。 2.3.3Masson染色 各組肺組織經(jīng)Masson染色后,光鏡下觀察可見,正常對照組動物肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁周圍有少量藍(lán)色膠原纖維,腔內(nèi)無膠原蛋白沉積；模型組動物肺泡壁增厚明顯,大量膠原蛋白沉積與肺泡壁及肺泡腔內(nèi),肺泡腔狹窄變形,部分肺泡出現(xiàn)實變現(xiàn)象；DHA干預(yù)組動物肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁周圍及肺泡腔中無明顯膠原蛋白沉積,無實變現(xiàn)象；DHA對照組與正常對照組差別不明顯。 2.4肺組織中Smad7和SnoN蛋白表達(dá) 2.4.1免疫組織化學(xué)方法測定肺組織中Smad7和SnoN蛋白表達(dá) 鏡下觀察可見,Smad7表達(dá)于肺泡和上皮細(xì)胞中。正常對照組Smad7陽性著色面積大且密集,模型組陽性著色面積比正常對照組明顯減少,并且比較分散,DHA干預(yù)組的陽性著色面積較模型組增加,DHA對照組與對照組差別不明顯；積分光密度結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組積分光密度降低了63%(P0.01),與模型組相比,DHA干預(yù)組積分光密度比模型組增加了112.7%(P0.01),DHA對照組與正常對照組差別不明顯(P0.05)。 SnoN蛋白主要在肺泡中表達(dá),正常對照組SnoN蛋白陽性著色面積密集,分布均勻,與正常對照組比較,模型組陽性著色面積明顯減少,且分布不均勻,DHA干預(yù)組的陽性著色面積分布均勻,較模型組增加；與正常對照組相比,模型組積分光密度降低了41%(P0.01),與模型組比較,DHA干預(yù)組的積分光密度比模型組增加了42.4%(P0.01),DHA對照組與正常對照組無明顯差別(P0.05)。 2.4.2Western blotting測定肺組織中Smad7和SnoN蛋白表達(dá) Western blotting的結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。與正常對照組比較,模型組大鼠肺組織中Smad7及SnoN蛋白表達(dá)均顯著減少(P0.05,P0.01)；而提前給予DHA干預(yù)后,大鼠肺組織中的Smad7與SnoN蛋白表達(dá)均未明顯減少,與正常對照組無顯著差異(P0.05),說明DHA能夠有效抑制百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺組織Smad7和SnoN表達(dá)的降低；DHA對照組與正常對照組差別不大(P0.05)。 結(jié)論 1.DHA (500mg/kg.bw)可有效拮抗50mg/kg.bw PQ所致小鼠急性肺損傷。 2.DHA可顯著降低PQ誘導(dǎo)的肺臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物4-HNE、MDA蛋白加合物的產(chǎn)生,DHA可能通過其抗氧化活性,降低肺臟氧化應(yīng)激拮抗PQ致急性肺損傷。 3. DHA (500mg/kg.bw)可有效拮抗50mg/kg.bw PQ所致大鼠慢性肺纖維化。 4.PQ所致的肺纖維化可能與其抑制組織纖維化過程的兩個重要因子Smad7、 SnoN的蛋白表達(dá)有關(guān),DHA可能通過上調(diào)Smad7、SnoN的表達(dá)來減輕PQ所致的肺纖維化。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2397067