【摘要】：目的:研究二甲苯誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的特點及表觀遺傳機制。方法:不同濃度的二甲苯分別作用于體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞(HK-2),通過ELISA法檢測腎小管上皮細胞培養(yǎng)上清中中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)表達變化,流式技術(shù)檢測腎小管上皮細胞凋亡,Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3活性。采用人甲基化450K芯片和焦磷酸測序?qū)Χ妆秸T導(dǎo)損傷的腎小管上皮細胞DNA的CG位點進行甲基化篩選和驗證。結(jié)果:二甲苯誘導(dǎo)刺激后HK-2細胞NGAL表達增加,呈現(xiàn)劑量和時間依賴性;1.4mmol/L二甲苯作用48h后培養(yǎng)上清中NGAL的值較對照組顯著增加[(4.52±0.49)pg/ml vs(2.30±0.11)pg/ml,P0.01]。隨加入二甲苯濃度的增加,HK-2細胞的凋亡比例和Caspase-3活性明顯增加。甲基化芯片分析結(jié)果顯示,二甲苯刺激后,HK-2細胞有243條探針甲基化出現(xiàn)顯著差異,其中109條探針顯示為甲基化水平增高,134條探針顯示為甲基化水平降低,共涉及到138個基因。其中,細胞凋亡相關(guān)的基因(如Bax、FAF1等)出現(xiàn)了明顯的甲基化改變,FAF1甲基化水平降低,Bax甲基化水平升高。焦磷酸測序的分析結(jié)果顯示,二甲苯刺激后Bax基因(92%)的甲基化水平與對照組(85%)相比出現(xiàn)7%的甲基化改變;FAF1基因的甲基化水平比對照組降低6%,其甲基化改變的趨勢與芯片結(jié)果相一致。結(jié)論:二甲苯刺激可引起HK-2細胞的損傷和凋亡增加,Bax、FAF1等凋亡相關(guān)基因的甲基化水平改變可能參與二甲苯對腎小管上皮細胞損傷,其機制有待進一步研究。
[Abstract]:Aim: to study the characteristics and epigenetic mechanism of renal tubular epithelial cell injury induced by xylene. Methods: human renal tubular epithelial cells (HK-2) were treated with different concentrations of xylene in vitro. The expression of neutrophil gelatinase-associated lipid carrier protein (NGAL) in supernatant of cultured human renal tubular epithelial cells (TECs) was detected by ELISA assay. Apoptosis of renal tubular epithelial cells was detected by flow cytometry and Caspase-3 activity was detected by Caspase-3 assay kit. Methylation screening and verification of the CG site of the DNA of renal tubular epithelial cells induced by xylene were performed by human methylation 450K chip and pyrosequencing. Results: the expression of NGAL in HK-2 cells was increased in a dose-and time-dependent manner. The value of NGAL in supernatant cultured with 1.4mmol/L xylene for 48 h was significantly higher than that in control group [(4.52 鹵0.49) pg/ml vs (2.30 鹵0.11) pg/ml,P0.01]. With the increase of the concentration of xylene, the ratio of apoptosis and the activity of Caspase-3 increased significantly in HK-2 cells. The results of methylation chip analysis showed that there were significant differences in methylation of HK-2 cells induced by xylene, of which 109 showed increased methylation level and 134 showed decreased methylation level. A total of 138 genes were involved. Among them, apoptosis-related genes (such as Bax,FAF1) showed significant methylation changes, FAF1 methylation level decreased, and Bax methylation level increased. The results of pyrosequencing showed that the methylation level of Bax gene (92%) was 7% higher than that of control group (85%). The methylation level of FAF1 gene was 6% lower than that of control group, and the trend of methylation change was consistent with the results of microarray. Conclusion: the methylation level of apoptosis-related genes such as Bax,FAF1 may be involved in the injury of renal tubular epithelial cells induced by xylene, and the mechanism needs further study.
【作者單位】： 南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腎臟科國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心全軍腎臟病研究所;
【基金】：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃[973計劃(2012CB517600)(2012CB517605)] 國家自然科學基金(81270811)
【分類號】：R114

【參考文獻】

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