【摘要】：雜色曲霉素（Sterigmatocystin，ST）是由雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉等真菌所產(chǎn)生的一種具有致癌性的真菌毒素，其污染非常普遍，廣泛存在于小麥、玉米、豆類等糧食作物和面包、奶酪等食品中。此外，ST在環(huán)境中的污染也比較常見(jiàn)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在潮濕房屋的地毯上和建筑材料中可以檢出ST的污染。目前研究表明，ST可引起多種器官的損傷及致癌作用，國(guó)際癌癥研究中心已將ST列為“可能的人類致癌物”。因此，ST暴露對(duì)機(jī)體的影響是值得關(guān)注的一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題。 河北省南部太行山區(qū)是世界食管癌高發(fā)區(qū)之一，本課題組對(duì)河北省食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中真菌及其毒素污染狀況進(jìn)行了多年的監(jiān)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鼐用耧嬍持姓婢舅氐奈廴竞車?yán)重，其中ST是主要污染霉菌毒素之一，其污染率高達(dá)60.25%，平均含量達(dá)9.14μg/kg。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期食用該地區(qū)ST污染的飼料可以誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)食管癌前病變，提示ST的高污染可能是食管癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。因此，有必要深入探討ST對(duì)人食管上皮細(xì)胞的損傷作用。 本研究在前期流行病學(xué)調(diào)查及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，利用永生化的人食管上皮細(xì)胞（Het-1A）和原代培養(yǎng)的人食管上皮細(xì)胞（EPC）作為研究對(duì)象，探討ST對(duì)人食管上皮細(xì)胞的損傷作用。研究分為三部分,第一部分首先觀察ST對(duì)Het-1A細(xì)胞株DNA的損傷作用以及對(duì)DNA修復(fù)系統(tǒng)和細(xì)胞周期分布的影響，然后進(jìn)一步探討錯(cuò)配修復(fù)基因的作用。第二部分通過(guò)分離培養(yǎng)原代人食管上皮細(xì)胞，進(jìn)一步研究ST對(duì)EPC細(xì)胞DNA的損傷作用以及對(duì)細(xì)胞周期的影響，并初步探討了Het-1A細(xì)胞和EPC細(xì)胞發(fā)生不同周期阻滯的原因。第三部分深入系統(tǒng)地研究了ATM-Chk2和p53-p21信號(hào)通路在ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞和EPC細(xì)胞周期阻滯中的作用。本研究結(jié)果為揭示ST暴露與人食管上皮損傷乃至食管癌發(fā)生的可能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，對(duì)提高我國(guó)農(nóng)村居民，特別是食管癌高發(fā)區(qū)居民食品安全水平具有重要意義。 第一部分錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1在雜色曲霉素誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致Het-1A細(xì)胞發(fā)生G_2期阻滯中的作用 目的：探討錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1在ST誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致Het-1A細(xì)胞發(fā)生G_2期阻滯中的作用。 方法： 1采用流式細(xì)胞定量檢測(cè)技術(shù)（FCM）、吉姆薩（Giemsa）染色和免疫熒光技術(shù)分析ST處理后Het-1A細(xì)胞周期分布情況。2采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）和熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Real time PCR）方法檢測(cè)ST處理后G_2期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在蛋白水平和mRNA水平上的表達(dá)情況。3采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成情況。4采用堿性彗星實(shí)驗(yàn)觀察ST處理后Het-1A細(xì)胞DNA損傷的情況。5采用Western Blot和Real time PCR方法檢測(cè)ST處理后DNA修復(fù)基因在蛋白水平和mRNA水平上的表達(dá)情況。6采用FCM和Western Blot方法檢測(cè)hMLH1siRNA干擾對(duì)細(xì)胞周期分布及細(xì)胞G_2期關(guān)鍵調(diào)控因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的影響。7采用堿性彗星實(shí)驗(yàn)觀察hMLH1siRNA干擾對(duì)ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞DNA損傷的影響。 結(jié)果： 1ST對(duì)Het-1A細(xì)胞周期分布的影響 FCM結(jié)果顯示，6、12和24μM ST處理組Het-1A細(xì)胞G_2/M期的細(xì)胞比例較溶劑對(duì)照組明顯增加（P0.05）。吉姆薩染色結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組有絲分裂指數(shù)（MI）（8.02±0.59%）相比，12和24μM ST處理組細(xì)胞MI（5.77±0.23%和5.35±0.28%）明顯降低（P0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示24μM ST處理組細(xì)胞表達(dá)有絲分裂期標(biāo)志蛋白p-H3（Ser-10）的細(xì)胞數(shù)明顯少于溶劑對(duì)照組。以上結(jié)果表明，ST處理可以誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞周期發(fā)生G_2期阻滯。 2ST對(duì)Het-1A細(xì)胞G_2期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響 Western Blot結(jié)果顯示，ST處理可以上調(diào)Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)ST處理還可以升高Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平。免疫共沉淀結(jié)果顯示，ST處理組Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成明顯少于溶劑對(duì)照組。Real-time PCR結(jié)果顯示ST處理可以上調(diào)Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在mRNA水平上的表達(dá)（P0.05）。 3ST對(duì)Het-1A細(xì)胞DNA的損傷作用 熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)溶劑對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，少有“彗星”現(xiàn)象的發(fā)生，而24μM ST處理組細(xì)胞電泳后出現(xiàn)了較多的“彗星”現(xiàn)象，且彗星拖尾明顯。經(jīng)CASP軟件進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，ST處理組Het-1A細(xì)胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明顯高于溶劑對(duì)照組（P0.05）。結(jié)果提示ST可以誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞DNA損傷。 4ST對(duì)Het-1A細(xì)胞DNA修復(fù)系統(tǒng)的影響 Real-time PCR結(jié)果表明，ST處理Het-1A細(xì)胞24h后，XPC、hMLH1和hMSH2的mRNA表達(dá)量均明顯高于溶劑對(duì)照組（P0.05），而ST處理組細(xì)胞內(nèi)XRCC1、RAD51和DNA-PK的mRNA表達(dá)量與溶劑對(duì)照組相比均未發(fā)生明顯變化（P0.05）。提示ST誘導(dǎo)的DNA損傷可以啟動(dòng)核苷酸切除修復(fù)（NER）和錯(cuò)配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證ST對(duì)MMR系統(tǒng)的影響，我們采用Western Blot方法觀察了ST處理Het-1A細(xì)胞后hMLH1和hMSH2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ST處理Het-1A細(xì)胞24h后，hMLH1和hMSH2蛋白的表達(dá)水平明顯高于溶劑對(duì)照組（P0.05）。 5hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干擾效率的檢測(cè) hMLH1、hMSH2siRNA以及Control siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示：hMLH1和hMSH2siRNA可以顯著抑制Het-1A細(xì)胞hMLH1和hMSH2mRNA及蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明，hMLH1和hMSH2siRNA序列可以明顯干擾hMLH1和hMSH2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)選擇hMLH1和hMSH2siRNA序列進(jìn)行研究。 6hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干擾對(duì)ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯的影響 FCM結(jié)果顯示，hMLH1siRNA+DMSO處理組，細(xì)胞周期分布與Control siRNA+DMSO處理組相比，沒(méi)有明顯變化（P0.05）。與ControlsiRNA+24μM ST處理組相比，hMLH1siRNA+24μM ST處理組G_2/M期細(xì)胞比例則明顯降低（P0.05），但仍高于Control siRNA+DMSO處理組（P0.05）。表明hMLH1siRNA轉(zhuǎn)染可以部分降低ST誘導(dǎo)的細(xì)胞G_2/M期比例增高。然而有趣的是，hMSH2siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯無(wú)明顯影響（P0.05）。提示hMLH1的激活可能部分參與了ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯，而hMSH2的激活并未參與G_2期阻滯的發(fā)生。 7hMLH1siRNA干擾對(duì)Het-1A細(xì)胞G_2期調(diào)控蛋白的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，hMLH1siRNA+DMSO處理組細(xì)胞內(nèi)Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達(dá)水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平與Control siRNA+DMSO處理組相比均沒(méi)有明顯差異（P0.05）。與Control siRNA+24μM ST處理組相比，hMLH1siRNA+24μM ST處理組Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達(dá)水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平明顯降低，但仍高于Control siRNA+DMSO處理組（P0.05）。提示hMLH1siRNA干擾可以部分逆轉(zhuǎn)ST上調(diào)G_2期調(diào)控蛋白的作用。 8hMLH1在ST誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯中的作用模式 采用堿性彗星實(shí)驗(yàn)方法觀察hMLH1siRNA干擾對(duì)ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞DNA損傷的影響。結(jié)果顯示，hMLH1siRNA+DMSO和ControlsiRNA+DMSO處理組細(xì)胞呈圓形，少有“彗星”現(xiàn)象的發(fā)生；而ControlsiRNA+24μM ST和hMLH1siRNA+24μM ST處理組細(xì)胞電泳后均出現(xiàn)了較多的“彗星”現(xiàn)象，兩者無(wú)明顯差異。經(jīng)CASP軟件進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與hMLH1siRNA+DMSO和Control siRNA+DMSO處理組相比，Control siRNA+24μM ST和hMLH1siRNA+24μM ST處理組Het-1A細(xì)胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明顯增高，但后兩者之間相比無(wú)明顯差異（P0.05）。結(jié)果表明，ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞DNA損傷后，hMLH1并未導(dǎo)致二次損傷的發(fā)生。提示ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞DNA損傷后，hMLH1通過(guò)DNA損傷應(yīng)答的普遍模式導(dǎo)致G_2期阻滯的發(fā)生。 第二部分SV40大T抗原在雜色曲霉素誘導(dǎo)EPC細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞發(fā)生不同周期阻滯中的作用 目的：探討SV40大T抗原（SV40LT）在ST誘導(dǎo)EPC細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞發(fā)生不同周期阻滯中的作用。 方法：1采用堿性彗星實(shí)驗(yàn)觀察ST處理后EPC細(xì)胞DNA損傷的情況。2采用FCM技術(shù)分析ST處理后EPC細(xì)胞周期分布情況。3采用Western Blot方法檢測(cè)ST處理EPC細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞后G_1期關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)情況。4采用FCM和Western Blot方法檢測(cè)SV40LT siRNA干擾對(duì)細(xì)胞周期分布及細(xì)胞G_1和G_2期關(guān)鍵調(diào)控因子的影響。 結(jié)果： 1ST對(duì)EPC細(xì)胞DNA的損傷作用 熒光顯微鏡下觀察，，可見(jiàn)溶劑對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，少有“彗星”現(xiàn)象的發(fā)生，而24μM ST處理組細(xì)胞電泳后出現(xiàn)了較多的“彗星”現(xiàn)象，且彗星拖尾明顯。經(jīng)CASP軟件進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ST處理組EPC細(xì)胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明顯高于溶劑對(duì)照組（P0.05）。提示ST可以誘導(dǎo)EPC細(xì)胞發(fā)生DNA損傷。 2ST對(duì)EPC細(xì)胞周期分布的影響 FCM檢測(cè)結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組相比，除6μM ST處理組外，12μM和24μM ST處理組EPC細(xì)胞G0/G_1期的細(xì)胞比例明顯增加（P0.05）。提示ST處理可顯著影響原代培養(yǎng)的EPC細(xì)胞細(xì)胞周期分布，引起細(xì)胞G_1期阻滯。 3ST對(duì)EPC細(xì)胞G_1期關(guān)鍵調(diào)控因子的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，給予不同濃度ST作用24h后，EPC細(xì)胞Rb的蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達(dá)水平明顯減少，同時(shí)ST處理可以下調(diào)CyclinD1、Cdk4、CyclinE1和Cdk2蛋白的表達(dá)水平（P0.05）。 4ST對(duì)Het-1A細(xì)胞G_1期關(guān)鍵調(diào)控因子的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，給予不同濃度ST作用24h后，Het-1A細(xì)胞Rb的蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達(dá)水平明顯增加，同時(shí)ST處理可以下調(diào)Het-1A細(xì)胞內(nèi)CyclinD1和Cdk4蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)CyclinE1和Cdk2蛋白的表達(dá)水平（P0.05）。 5SV40LT siRNA干擾效率的檢測(cè) SV40LT siRNA以及Control siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞。Real-timePCR和Western blot結(jié)果顯示：SV40LT siRNA可以顯著降低Het-1A細(xì)胞SV40LT mRNA和蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明，SV40LT siRNA序列可以明顯干擾SV40LT在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)選擇該siRNA序列進(jìn)行研究。 6SV40LT siRNA干擾對(duì)ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞發(fā)生G_2期阻滯的影響 FCM結(jié)果顯示，SV40LT siRNA+DMSO處理組，細(xì)胞周期分布與Control siRNA+DMSO處理組相比，沒(méi)有明顯變化（P0.05）。與ControlsiRNA+24μM ST處理組相比，SV40LT siRNA+24μM ST處理組G0/G_1期細(xì)胞比例明顯升高（P0.05），而G_2/M期細(xì)胞比例則明顯降低（P0.05），但仍高于Control siRNA+DMSO處理組（P0.05）。 7SV40LT siRNA干擾對(duì)Het-1A細(xì)胞G_1期關(guān)鍵調(diào)控因子（Rb/p-Rb和E2F1）的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SV40LT siRNA+DMSO處理組細(xì)胞內(nèi)Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達(dá)水平與ControlsiRNA+DMSO處理組相比均沒(méi)有明顯差異（P0.05）。與Control siRNA+24μM ST處理組相比，SV40LT siRNA+24μM ST處理組Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P0.05）。 8SV40LT siRNA干擾對(duì)Het-1A細(xì)胞G_2期關(guān)鍵調(diào)控因子（Cdc2/p-Cdc2和CyclinB1）的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SV40LT siRNA+DMSO處理組細(xì)胞內(nèi)Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表達(dá)水平與ControlsiRNA+DMSO處理組相比均沒(méi)有明顯差異（P0.05）。與Control siRNA+24μM ST處理組相比，SV40LT siRNA+24μM ST處理組Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P0.05）。 綜合以上結(jié)果表明，敲低Het-1A細(xì)胞中的SV40LT抗原會(huì)部分逆轉(zhuǎn)ST對(duì)Het-1A細(xì)胞周期分布及G_1期和G_2期調(diào)控蛋白的影響，并且低表達(dá)SV40LT抗原的Het-1A細(xì)胞被ST處理后，有發(fā)生G_1期阻滯的傾向。提示在SV40LT抗原存在的情況下，Het-1A細(xì)胞不會(huì)發(fā)生G_1期阻滯。 第三部分ATM-Chk2和p53-p21信號(hào)通路在雜色曲霉素誘導(dǎo)的Het-1A及EPC細(xì)胞周期阻滯中的作用 目的：探討雜色曲霉素誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯和EPC細(xì)胞G_1期阻滯的可能分子機(jī)制。 方法：1采用Western Blot方法觀察ST單獨(dú)處理后ATM-Chk2和p53-p21信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況。2給予ATM特異性抑制劑KU55933預(yù)處理后檢測(cè)Het-1A細(xì)胞中ATM-Chk2信號(hào)通路的激活情況以及Het-1A細(xì)胞周期的分布情況。3采用FCM和Western Blot方法觀察p53siRNA干擾對(duì)細(xì)胞周期分布及細(xì)胞G_2期關(guān)鍵調(diào)控因子的影響。 結(jié)果： 1ST處理對(duì)EPC細(xì)胞ATM-Chk2和p53-p21信號(hào)通路的影響 Western Blot結(jié)果顯示，24μM ST處理EPC細(xì)胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表達(dá)水平較溶劑對(duì)照組相比無(wú)明顯差別（P0.05）。但是，24μM ST處理組ATM和Chk2的磷酸化水平則較溶劑對(duì)照組明顯升高（P0.05）。提示ST可以激活EPC細(xì)胞中的ATM-Chk2信號(hào)通路。 Western Blot結(jié)果顯示，24μM ST處理EPC細(xì)胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表達(dá)水平較溶劑對(duì)照組相比明顯降低（P0.05）。提示ST沒(méi)有激活EPC細(xì)胞中的p53-p21信號(hào)通路。 以上結(jié)果提示：ST處理可以激活EPC細(xì)胞中的ATM-Chk2信號(hào)通路，而p53-p21信號(hào)通路沒(méi)有被激活。 2ST對(duì)Het-1A細(xì)胞ATM-Chk2和p53-p21信號(hào)通路的影響 Western Blot結(jié)果顯示，24μM ST處理Het-1A細(xì)胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表達(dá)水平較溶劑對(duì)照組相比無(wú)明顯差別（P0.05）。但是，24μM ST處理組ATM和Chk2的磷酸化水平則較溶劑對(duì)照組明顯升高（P0.05）。提示ST可以激活Het-1A細(xì)胞中的ATM-Chk2信號(hào)通路。 Western Blot結(jié)果顯示，24μM ST處理Het-1A細(xì)胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表達(dá)水平較溶劑對(duì)照組相比明顯升高（P0.05）。提示ST處理可以激活Het-1A細(xì)胞中的p53-p21信號(hào)通路。 以上結(jié)果提示：ST處理后Het-1A細(xì)胞中的ATM-Chk2和p53-p21信號(hào)通路被激活。 3KU55933預(yù)處理對(duì)Het-1A細(xì)胞中ATM-Chk2信號(hào)通路的影響 給予ATM特異性抑制劑KU55933預(yù)處理后進(jìn)一步觀察ST對(duì)ATM-Chk2信號(hào)通路的影響。Western Blot結(jié)果顯示，KU55933預(yù)處理+ST處理組ATM和Chk2的磷酸化水平較ST單獨(dú)處理組明顯下降（P0.05），表明KU55933可以阻斷ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞ATM-Chk2信號(hào)通路的激活。 4KU55933預(yù)處理對(duì)ST作用后Het-1A細(xì)胞周期的影響 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，與ST單獨(dú)處理組相比，KU55933預(yù)處理+ST處理組細(xì)胞周期分布無(wú)明顯改變（P0.05）。表明KU55933預(yù)處理不影響ST誘導(dǎo)的G_2/M期細(xì)胞比例增高，提示ATM-Chk2信號(hào)通路的激活并不參與ST誘導(dǎo)Het-1A細(xì)胞的G_2期阻滯。 5p53siRNA干擾效率的檢測(cè) p53siRNA以及Control siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞。Real-timePCR和Western blot結(jié)果顯示：p53siRNA可以顯著降低Het-1A細(xì)胞p53mRNA和蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明，p53siRNA序列可以明顯干擾p53在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)選擇該siRNA序列進(jìn)行研究。 6p53siRNA干擾對(duì)p53-p21信號(hào)通路的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control siRNA+24μM ST處理組相比，p53siRNA+24μM ST處理組p53的磷酸化水平以及p53和p21的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P0.05）。提示p53siRNA干擾可以阻斷ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞p53-p21信號(hào)通路的激活。 7p53siRNA干擾對(duì)ST作用后Het-1A細(xì)胞周期的影響 FCM結(jié)果顯示，與Control siRNA+24μM ST處理組相比，p53siRNA+24μM ST處理組S期細(xì)胞比例明顯升高（P0.05），而G_2/M期細(xì)胞比例則明顯降低（P0.05）。表明p53siRNA轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2/M期比例增高。提示p53的激活參與了ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯。 8p53siRNA干擾對(duì)ST作用后Het-1A細(xì)胞G_2期關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)變化的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control siRNA+24μM ST處理組相比，p53siRNA+24μM ST處理組Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達(dá)水平以及Cdc25C和Cdc2磷酸化明顯降低（P0.05）。提示p53siRNA干擾可以逆轉(zhuǎn)ST上調(diào)G_2期調(diào)控蛋白的作用。 綜上結(jié)果表明，ST處理可以激活Het-1A細(xì)胞中ATM-Chk2、p53-p21信號(hào)通路，進(jìn)一步阻斷實(shí)驗(yàn)表明，ATM-Chk2信號(hào)通路的激活并不參與ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞周期G_2期阻滯，而p53-p21信號(hào)通路的激活參與調(diào)控ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯。 結(jié)論： 1ST可以誘導(dǎo)DNA損傷，導(dǎo)致Het-1A細(xì)胞發(fā)生G_2期阻滯。 2hMLH1可能作為DNA損傷的直接感應(yīng)因子啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，上調(diào) G_2/M期關(guān)鍵調(diào)控因子（CyclinB1、Cdc2/p-Cdc2和Cdc25C/p-Cdc25C），進(jìn)而參與ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯。 3ST可以誘導(dǎo)DNA損傷，導(dǎo)致EPC細(xì)胞發(fā)生G_1期阻滯。 4ST誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷后，EPC細(xì)胞發(fā)生G_1期阻滯很可能是人食管上皮細(xì)胞對(duì)ST-DNA損傷的一般應(yīng)答反應(yīng)，而Het-1A細(xì)胞由于 SV40LT抗原的存在缺失G_1期檢測(cè)點(diǎn)功能而掩蓋了人食管上皮細(xì)胞的這一應(yīng)答反應(yīng)。 5ATM-Chk2信號(hào)通路的激活，可能參與ST誘導(dǎo)的EPC細(xì)胞G_1期阻滯，而不參與ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯。 6p53-p21信號(hào)通路的激活可能通過(guò)調(diào)控G_2期關(guān)鍵調(diào)控因子，進(jìn)而參與ST誘導(dǎo)的Het-1A細(xì)胞G_2期阻滯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2385367