【摘要】：雜色曲霉素（Sterigmatocystin，ST）是由雜色曲霉、構巢曲霉等真菌所產生的一種具有致癌性的真菌毒素，其污染非常普遍，廣泛存在于小麥、玉米、豆類等糧食作物和面包、奶酪等食品中。此外，ST在環(huán)境中的污染也比較常見，有學者發(fā)現在潮濕房屋的地毯上和建筑材料中可以檢出ST的污染。目前研究表明，ST可引起多種器官的損傷及致癌作用，國際癌癥研究中心已將ST列為“可能的人類致癌物”。因此，ST暴露對機體的影響是值得關注的一個公共衛(wèi)生問題。 河北省南部太行山區(qū)是世界食管癌高發(fā)區(qū)之一，本課題組對河北省食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中真菌及其毒素污染狀況進行了多年的監(jiān)測分析，發(fā)現當地居民飲食中真菌毒素的污染很嚴重，其中ST是主要污染霉菌毒素之一，其污染率高達60.25%，平均含量達9.14μg/kg。前期的動物實驗發(fā)現，長期食用該地區(qū)ST污染的飼料可以誘發(fā)實驗動物出現食管癌前病變，提示ST的高污染可能是食管癌發(fā)生的重要危險因素。因此，有必要深入探討ST對人食管上皮細胞的損傷作用。 本研究在前期流行病學調查及動物實驗的基礎之上，利用永生化的人食管上皮細胞（Het-1A）和原代培養(yǎng)的人食管上皮細胞（EPC）作為研究對象，探討ST對人食管上皮細胞的損傷作用。研究分為三部分,第一部分首先觀察ST對Het-1A細胞株DNA的損傷作用以及對DNA修復系統和細胞周期分布的影響，然后進一步探討錯配修復基因的作用。第二部分通過分離培養(yǎng)原代人食管上皮細胞，進一步研究ST對EPC細胞DNA的損傷作用以及對細胞周期的影響，并初步探討了Het-1A細胞和EPC細胞發(fā)生不同周期阻滯的原因。第三部分深入系統地研究了ATM-Chk2和p53-p21信號通路在ST誘導Het-1A細胞和EPC細胞周期阻滯中的作用。本研究結果為揭示ST暴露與人食管上皮損傷乃至食管癌發(fā)生的可能關系奠定了基礎，對提高我國農村居民，特別是食管癌高發(fā)區(qū)居民食品安全水平具有重要意義。 第一部分錯配修復基因hMLH1在雜色曲霉素誘導DNA損傷導致Het-1A細胞發(fā)生G_2期阻滯中的作用 目的：探討錯配修復基因hMLH1在ST誘導DNA損傷導致Het-1A細胞發(fā)生G_2期阻滯中的作用。 方法： 1采用流式細胞定量檢測技術（FCM）、吉姆薩（Giemsa）染色和免疫熒光技術分析ST處理后Het-1A細胞周期分布情況。2采用蛋白質免疫印跡（Western Blot）和熒光實時定量PCR（Real time PCR）方法檢測ST處理后G_2期關鍵調節(jié)因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在蛋白水平和mRNA水平上的表達情況。3采用免疫共沉淀技術檢測Cdc2-CyclinB1復合物的形成情況。4采用堿性彗星實驗觀察ST處理后Het-1A細胞DNA損傷的情況。5采用Western Blot和Real time PCR方法檢測ST處理后DNA修復基因在蛋白水平和mRNA水平上的表達情況。6采用FCM和Western Blot方法檢測hMLH1siRNA干擾對細胞周期分布及細胞G_2期關鍵調控因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的影響。7采用堿性彗星實驗觀察hMLH1siRNA干擾對ST誘導Het-1A細胞DNA損傷的影響。 結果： 1ST對Het-1A細胞周期分布的影響 FCM結果顯示，6、12和24μM ST處理組Het-1A細胞G_2/M期的細胞比例較溶劑對照組明顯增加（P0.05）。吉姆薩染色結果顯示，與溶劑對照組有絲分裂指數（MI）（8.02±0.59%）相比，12和24μM ST處理組細胞MI（5.77±0.23%和5.35±0.28%）明顯降低（P0.05）。免疫熒光結果顯示24μM ST處理組細胞表達有絲分裂期標志蛋白p-H3（Ser-10）的細胞數明顯少于溶劑對照組。以上結果表明，ST處理可以誘導Het-1A細胞周期發(fā)生G_2期阻滯。 2ST對Het-1A細胞G_2期關鍵調節(jié)因子的影響 Western Blot結果顯示，ST處理可以上調Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達水平，同時ST處理還可以升高Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平。免疫共沉淀結果顯示，ST處理組Cdc2-CyclinB1復合物的形成明顯少于溶劑對照組。Real-time PCR結果顯示ST處理可以上調Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在mRNA水平上的表達（P0.05）。 3ST對Het-1A細胞DNA的損傷作用 熒光顯微鏡下觀察，可見溶劑對照組細胞呈圓形，少有“彗星”現象的發(fā)生，而24μM ST處理組細胞電泳后出現了較多的“彗星”現象，且彗星拖尾明顯。經CASP軟件進一步統計分析發(fā)現，ST處理組Het-1A細胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明顯高于溶劑對照組（P0.05）。結果提示ST可以誘導Het-1A細胞DNA損傷。 4ST對Het-1A細胞DNA修復系統的影響 Real-time PCR結果表明，ST處理Het-1A細胞24h后，XPC、hMLH1和hMSH2的mRNA表達量均明顯高于溶劑對照組（P0.05），而ST處理組細胞內XRCC1、RAD51和DNA-PK的mRNA表達量與溶劑對照組相比均未發(fā)生明顯變化（P0.05）。提示ST誘導的DNA損傷可以啟動核苷酸切除修復（NER）和錯配修復（MMR）系統。 為了進一步驗證ST對MMR系統的影響，我們采用Western Blot方法觀察了ST處理Het-1A細胞后hMLH1和hMSH2蛋白的表達情況。結果顯示，ST處理Het-1A細胞24h后，hMLH1和hMSH2蛋白的表達水平明顯高于溶劑對照組（P0.05）。 5hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干擾效率的檢測 hMLH1、hMSH2siRNA以及Control siRNA轉染48小時后收集細胞。Real-time PCR和Western blot結果顯示：hMLH1和hMSH2siRNA可以顯著抑制Het-1A細胞hMLH1和hMSH2mRNA及蛋白的表達。上述結果表明，hMLH1和hMSH2siRNA序列可以明顯干擾hMLH1和hMSH2在mRNA和蛋白水平的表達。因此，后續(xù)的實驗中繼續(xù)選擇hMLH1和hMSH2siRNA序列進行研究。 6hMLH1siRNA和hMSH2siRNA干擾對ST誘導Het-1A細胞G_2期阻滯的影響 FCM結果顯示，hMLH1siRNA+DMSO處理組，細胞周期分布與Control siRNA+DMSO處理組相比，沒有明顯變化（P0.05）。與ControlsiRNA+24μM ST處理組相比，hMLH1siRNA+24μM ST處理組G_2/M期細胞比例則明顯降低（P0.05），但仍高于Control siRNA+DMSO處理組（P0.05）。表明hMLH1siRNA轉染可以部分降低ST誘導的細胞G_2/M期比例增高。然而有趣的是，hMSH2siRNA轉染對ST誘導的Het-1A細胞G_2期阻滯無明顯影響（P0.05）。提示hMLH1的激活可能部分參與了ST誘導的Het-1A細胞G_2期阻滯，而hMSH2的激活并未參與G_2期阻滯的發(fā)生。 7hMLH1siRNA干擾對Het-1A細胞G_2期調控蛋白的影響 Western Blot檢測結果顯示，hMLH1siRNA+DMSO處理組細胞內Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平與Control siRNA+DMSO處理組相比均沒有明顯差異（P0.05）。與Control siRNA+24μM ST處理組相比，hMLH1siRNA+24μM ST處理組Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平明顯降低，但仍高于Control siRNA+DMSO處理組（P0.05）。提示hMLH1siRNA干擾可以部分逆轉ST上調G_2期調控蛋白的作用。 8hMLH1在ST誘導DNA損傷導致Het-1A細胞G_2期阻滯中的作用模式 采用堿性彗星實驗方法觀察hMLH1siRNA干擾對ST誘導Het-1A細胞DNA損傷的影響。結果顯示，hMLH1siRNA+DMSO和ControlsiRNA+DMSO處理組細胞呈圓形，少有“彗星”現象的發(fā)生；而ControlsiRNA+24μM ST和hMLH1siRNA+24μM ST處理組細胞電泳后均出現了較多的“彗星”現象，兩者無明顯差異。經CASP軟件進一步統計分析發(fā)現，與hMLH1siRNA+DMSO和Control siRNA+DMSO處理組相比，Control siRNA+24μM ST和hMLH1siRNA+24μM ST處理組Het-1A細胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明顯增高，但后兩者之間相比無明顯差異（P0.05）。結果表明，ST誘導Het-1A細胞DNA損傷后，hMLH1并未導致二次損傷的發(fā)生。提示ST誘導Het-1A細胞DNA損傷后，hMLH1通過DNA損傷應答的普遍模式導致G_2期阻滯的發(fā)生。 第二部分SV40大T抗原在雜色曲霉素誘導EPC細胞和Het-1A細胞發(fā)生不同周期阻滯中的作用 目的：探討SV40大T抗原（SV40LT）在ST誘導EPC細胞和Het-1A細胞發(fā)生不同周期阻滯中的作用。 方法：1采用堿性彗星實驗觀察ST處理后EPC細胞DNA損傷的情況。2采用FCM技術分析ST處理后EPC細胞周期分布情況。3采用Western Blot方法檢測ST處理EPC細胞和Het-1A細胞后G_1期關鍵調控因子的表達情況。4采用FCM和Western Blot方法檢測SV40LT siRNA干擾對細胞周期分布及細胞G_1和G_2期關鍵調控因子的影響。 結果： 1ST對EPC細胞DNA的損傷作用 熒光顯微鏡下觀察，，可見溶劑對照組細胞呈圓形，少有“彗星”現象的發(fā)生，而24μM ST處理組細胞電泳后出現了較多的“彗星”現象，且彗星拖尾明顯。經CASP軟件進一步統計分析發(fā)現，與對照組相比，ST處理組EPC細胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明顯高于溶劑對照組（P0.05）。提示ST可以誘導EPC細胞發(fā)生DNA損傷。 2ST對EPC細胞周期分布的影響 FCM檢測結果表明，與溶劑對照組相比，除6μM ST處理組外，12μM和24μM ST處理組EPC細胞G0/G_1期的細胞比例明顯增加（P0.05）。提示ST處理可顯著影響原代培養(yǎng)的EPC細胞細胞周期分布，引起細胞G_1期阻滯。 3ST對EPC細胞G_1期關鍵調控因子的影響 Western Blot檢測結果顯示，與溶劑對照組相比，給予不同濃度ST作用24h后，EPC細胞Rb的蛋白表達水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達水平明顯減少，同時ST處理可以下調CyclinD1、Cdk4、CyclinE1和Cdk2蛋白的表達水平（P0.05）。 4ST對Het-1A細胞G_1期關鍵調控因子的影響 Western Blot檢測結果顯示，與溶劑對照組相比，給予不同濃度ST作用24h后，Het-1A細胞Rb的蛋白表達水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達水平明顯增加，同時ST處理可以下調Het-1A細胞內CyclinD1和Cdk4蛋白的表達水平，同時上調CyclinE1和Cdk2蛋白的表達水平（P0.05）。 5SV40LT siRNA干擾效率的檢測 SV40LT siRNA以及Control siRNA轉染48小時后收集細胞。Real-timePCR和Western blot結果顯示：SV40LT siRNA可以顯著降低Het-1A細胞SV40LT mRNA和蛋白的表達。上述結果表明，SV40LT siRNA序列可以明顯干擾SV40LT在mRNA和蛋白水平的表達。因此，后續(xù)的實驗中繼續(xù)選擇該siRNA序列進行研究。 6SV40LT siRNA干擾對ST誘導Het-1A細胞發(fā)生G_2期阻滯的影響 FCM結果顯示，SV40LT siRNA+DMSO處理組，細胞周期分布與Control siRNA+DMSO處理組相比，沒有明顯變化（P0.05）。與ControlsiRNA+24μM ST處理組相比，SV40LT siRNA+24μM ST處理組G0/G_1期細胞比例明顯升高（P0.05），而G_2/M期細胞比例則明顯降低（P0.05），但仍高于Control siRNA+DMSO處理組（P0.05）。 7SV40LT siRNA干擾對Het-1A細胞G_1期關鍵調控因子（Rb/p-Rb和E2F1）的影響 Western Blot檢測結果顯示，SV40LT siRNA+DMSO處理組細胞內Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達水平與ControlsiRNA+DMSO處理組相比均沒有明顯差異（P0.05）。與Control siRNA+24μM ST處理組相比，SV40LT siRNA+24μM ST處理組Rb的蛋白水平和磷酸化水平以及E2F1的蛋白表達水平明顯降低（P0.05）。 8SV40LT siRNA干擾對Het-1A細胞G_2期關鍵調控因子（Cdc2/p-Cdc2和CyclinB1）的影響 Western Blot檢測結果顯示，SV40LT siRNA+DMSO處理組細胞內Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表達水平與ControlsiRNA+DMSO處理組相比均沒有明顯差異（P0.05）。與Control siRNA+24μM ST處理組相比，SV40LT siRNA+24μM ST處理組Cdc2的蛋白水平和磷酸化水平以及CyclinB1的蛋白表達水平明顯降低（P0.05）。 綜合以上結果表明，敲低Het-1A細胞中的SV40LT抗原會部分逆轉ST對Het-1A細胞周期分布及G_1期和G_2期調控蛋白的影響，并且低表達SV40LT抗原的Het-1A細胞被ST處理后，有發(fā)生G_1期阻滯的傾向。提示在SV40LT抗原存在的情況下，Het-1A細胞不會發(fā)生G_1期阻滯。 第三部分ATM-Chk2和p53-p21信號通路在雜色曲霉素誘導的Het-1A及EPC細胞周期阻滯中的作用 目的：探討雜色曲霉素誘導Het-1A細胞G_2期阻滯和EPC細胞G_1期阻滯的可能分子機制。 方法：1采用Western Blot方法觀察ST單獨處理后ATM-Chk2和p53-p21信號通路相關分子的表達情況。2給予ATM特異性抑制劑KU55933預處理后檢測Het-1A細胞中ATM-Chk2信號通路的激活情況以及Het-1A細胞周期的分布情況。3采用FCM和Western Blot方法觀察p53siRNA干擾對細胞周期分布及細胞G_2期關鍵調控因子的影響。 結果： 1ST處理對EPC細胞ATM-Chk2和p53-p21信號通路的影響 Western Blot結果顯示，24μM ST處理EPC細胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表達水平較溶劑對照組相比無明顯差別（P0.05）。但是，24μM ST處理組ATM和Chk2的磷酸化水平則較溶劑對照組明顯升高（P0.05）。提示ST可以激活EPC細胞中的ATM-Chk2信號通路。 Western Blot結果顯示，24μM ST處理EPC細胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表達水平較溶劑對照組相比明顯降低（P0.05）。提示ST沒有激活EPC細胞中的p53-p21信號通路。 以上結果提示：ST處理可以激活EPC細胞中的ATM-Chk2信號通路，而p53-p21信號通路沒有被激活。 2ST對Het-1A細胞ATM-Chk2和p53-p21信號通路的影響 Western Blot結果顯示，24μM ST處理Het-1A細胞24h后，ATM和Chk2蛋白的表達水平較溶劑對照組相比無明顯差別（P0.05）。但是，24μM ST處理組ATM和Chk2的磷酸化水平則較溶劑對照組明顯升高（P0.05）。提示ST可以激活Het-1A細胞中的ATM-Chk2信號通路。 Western Blot結果顯示，24μM ST處理Het-1A細胞24h后，p53的磷酸化水平以及p53和p21蛋白的表達水平較溶劑對照組相比明顯升高（P0.05）。提示ST處理可以激活Het-1A細胞中的p53-p21信號通路。 以上結果提示：ST處理后Het-1A細胞中的ATM-Chk2和p53-p21信號通路被激活。 3KU55933預處理對Het-1A細胞中ATM-Chk2信號通路的影響 給予ATM特異性抑制劑KU55933預處理后進一步觀察ST對ATM-Chk2信號通路的影響。Western Blot結果顯示，KU55933預處理+ST處理組ATM和Chk2的磷酸化水平較ST單獨處理組明顯下降（P0.05），表明KU55933可以阻斷ST誘導的Het-1A細胞ATM-Chk2信號通路的激活。 4KU55933預處理對ST作用后Het-1A細胞周期的影響 FCM檢測結果顯示，與ST單獨處理組相比，KU55933預處理+ST處理組細胞周期分布無明顯改變（P0.05）。表明KU55933預處理不影響ST誘導的G_2/M期細胞比例增高，提示ATM-Chk2信號通路的激活并不參與ST誘導Het-1A細胞的G_2期阻滯。 5p53siRNA干擾效率的檢測 p53siRNA以及Control siRNA轉染48小時后收集細胞。Real-timePCR和Western blot結果顯示：p53siRNA可以顯著降低Het-1A細胞p53mRNA和蛋白的表達。上述結果表明，p53siRNA序列可以明顯干擾p53在mRNA和蛋白水平的表達。因此，后續(xù)的實驗中繼續(xù)選擇該siRNA序列進行研究。 6p53siRNA干擾對p53-p21信號通路的影響 Western Blot檢測結果顯示，與Control siRNA+24μM ST處理組相比，p53siRNA+24μM ST處理組p53的磷酸化水平以及p53和p21的蛋白表達水平明顯降低（P0.05）。提示p53siRNA干擾可以阻斷ST誘導的Het-1A細胞p53-p21信號通路的激活。 7p53siRNA干擾對ST作用后Het-1A細胞周期的影響 FCM結果顯示，與Control siRNA+24μM ST處理組相比，p53siRNA+24μM ST處理組S期細胞比例明顯升高（P0.05），而G_2/M期細胞比例則明顯降低（P0.05）。表明p53siRNA轉染可以逆轉ST誘導的Het-1A細胞G_2/M期比例增高。提示p53的激活參與了ST誘導的Het-1A細胞G_2期阻滯。 8p53siRNA干擾對ST作用后Het-1A細胞G_2期關鍵調控因子表達變化的影響 Western Blot檢測結果顯示，與Control siRNA+24μM ST處理組相比，p53siRNA+24μM ST處理組Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表達水平以及Cdc25C和Cdc2磷酸化明顯降低（P0.05）。提示p53siRNA干擾可以逆轉ST上調G_2期調控蛋白的作用。 綜上結果表明，ST處理可以激活Het-1A細胞中ATM-Chk2、p53-p21信號通路，進一步阻斷實驗表明，ATM-Chk2信號通路的激活并不參與ST誘導的Het-1A細胞周期G_2期阻滯，而p53-p21信號通路的激活參與調控ST誘導的Het-1A細胞G_2期阻滯。 結論： 1ST可以誘導DNA損傷，導致Het-1A細胞發(fā)生G_2期阻滯。 2hMLH1可能作為DNA損傷的直接感應因子啟動信號級聯反應，上調 G_2/M期關鍵調控因子（CyclinB1、Cdc2/p-Cdc2和Cdc25C/p-Cdc25C），進而參與ST誘導的Het-1A細胞G_2期阻滯。 3ST可以誘導DNA損傷，導致EPC細胞發(fā)生G_1期阻滯。 4ST誘導細胞DNA損傷后，EPC細胞發(fā)生G_1期阻滯很可能是人食管上皮細胞對ST-DNA損傷的一般應答反應，而Het-1A細胞由于 SV40LT抗原的存在缺失G_1期檢測點功能而掩蓋了人食管上皮細胞的這一應答反應。 5ATM-Chk2信號通路的激活，可能參與ST誘導的EPC細胞G_1期阻滯，而不參與ST誘導的Het-1A細胞G_2期阻滯。 6p53-p21信號通路的激活可能通過調控G_2期關鍵調控因子，進而參與ST誘導的Het-1A細胞G_2期阻滯。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

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本文編號：2385367