【摘要】：目的 研究三鄰甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）的神經(jīng)毒性機(jī)制，觀察TOCP對calpain和蛋白酶體活性的影響，研究細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂與鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對TOCP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生自噬的作用機(jī)制，以及探討磷酸化和泛素化蛋白的降解機(jī)制。 方法 1.以RA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化，TOCP（0、0.25、0.5、1.0mM）染毒未分化與已分化的SH-SY5Y細(xì)胞12h、24h和48h，以DMSO為對照組，采用20μM verapamil、100μM2-APB、20μM verapamil合并100μM2-APB分別預(yù)處理未分化與已分化的SH-SY5Y細(xì)胞15min再染毒1.0mM TOCP48h，熒光分光光度計測calpain活性變化，并用Western Blot測鈣通道抑制后LC3-II/I蛋白表達(dá)。 2．500nM Calpastatin peptide ac184-210和自噬抑制劑3-MA（1.0mM）分別預(yù)處理未分化與已分化的SH-SY5Y細(xì)胞6h和4h后染毒1.0mM TOCP48h，DMSO為對照組，收集細(xì)胞，Western Blot測LC3II/I和Beclin1蛋白的表達(dá)。 3．不同濃度TOCP染毒未分化與已分化的SH-SY5Y細(xì)胞48h，Western Blot測MAP2、p62和Ub蛋白的表達(dá)。 4.培養(yǎng)未分化的SH-SY5Y細(xì)胞，用TOCP（0、0.25、0.5、1.0mM）進(jìn)行染毒，染毒時間分別為6h、12h、24h、48h和72h，熒光分光光度計測定20S和26S蛋白酶體活性變化。 結(jié)果 1. calpain活性變化：隨著TOCP染毒濃度和染毒時間增加，已分化與未分化的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)calpain活性升高（P0.05）；用verapamil、2-APB及verapamil合并2-APB預(yù)處理細(xì)胞后染毒TOCP發(fā)現(xiàn)，TOCP誘導(dǎo)的calpain活性均一定程度地受到抑制（P0.05）。 2.自噬蛋白表達(dá)：未分化與分化的SH-SY5Y細(xì)胞結(jié)果顯示，與對照組比較，1.0mM TOCP染毒組LC3-Ⅱ的表達(dá)均顯著增高（P0.05）；與1.0mM TOCP染毒組比較，verapamil預(yù)處理組抑制TOCP誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)（P0.05），verapamil合并2-APB組部分抑制LC3-Ⅱ的表達(dá)（P0.05），2-APB增高LC3-Ⅱ表達(dá)（未分化組：P0.05，分化組：P0.05）；在未分化的SH-SY5Y細(xì)胞，，calpastatin能抑制TOCP誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)，與對照組無差異（P0.05），部分抑制Beclin1表達(dá)（P0.05）；在分化的SHSY5Y細(xì)胞，calpastatin部分抑制LC3-Ⅱ和Beclin1的表達(dá)（P0.05）；未分化與分化的細(xì)胞中，3-MA+TOCP組LC3-Ⅱ和Beclin1均發(fā)生明顯的抑制作用（P0.05）。 3. p62、MAP-2和泛素化蛋白表達(dá)：未分化與分化的SH-SY5Y細(xì)胞中，隨著TOCP濃度增高，MAP-2和p62表達(dá)降低（P0.05），泛素化蛋白表達(dá)均增高，尤其是高分子量的蛋白泛素化表達(dá)更明顯。 4.蛋白酶體活性變化：不同濃度的TOCP染毒未分化的SH-SY5Y細(xì)胞不同時間，與對照組比較，20S proteasome CT-L、T-L、PGPH和26S proteasomeCT-L、PGPH活性在不同染毒濃度和時間出現(xiàn)不同程度的升高，26S proteasomeT-L活性隨著染毒濃度的增加和染毒時間的延長呈降低趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05，P0.01）。 結(jié)論 1. TOCP能誘導(dǎo)已分化與未分化的SH-SY5Y細(xì)胞calpain活性，T/L-型鈣離子通道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R參與細(xì)胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 2. T/L-型鈣離子通道造成細(xì)胞內(nèi)calpain活性改變是TOCP誘導(dǎo)自噬的重要原因。 3. TOCP能造成已分化與未分化的SH-SY5Y細(xì)胞泛素化積聚，抑制p62的表達(dá)，泛素化蛋白可能通過p62介導(dǎo)進(jìn)入自噬溶酶體途徑降解。
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【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2384989