【摘要】：研究背景 生殖支原體(Mycoplasma genitalium, Mg)是目前能在無生命條件下生長的最小原核細(xì)胞型微生物,可引起急慢性尿道炎、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、輸卵管性不孕等多種疾病,并且作為AIDS相關(guān)支原體與患者的死亡密切相關(guān)。因此,開展對(duì)Mg的致病機(jī)制研究有利于提高對(duì)Mg相關(guān)疾病的認(rèn)識(shí)和治療。： 到目前為止,與其它致病菌相比,在支原體中至今未發(fā)現(xiàn)類似于毒素、侵襲素、溶細(xì)胞素等典型的毒力因子,這主要是由于支原體基因組小,僅進(jìn)化有維持基本生命功能的遺傳物質(zhì)。因此,支原體可能通過內(nèi)源性結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物作為毒性效應(yīng)器從而發(fā)揮其致病作用。近年研究表明,支原體的致病性與其碳代謝密切相關(guān),并且不同的支原體利用的碳源有所不同。越來越多的研究表明,許多微生物擁有一套完整的甘油利用系統(tǒng),甘油可能涉及到其多種病理生理及致病過程。因此本課題擬選取Mg甘油代謝的兩個(gè)主要活性酶GlpK和GlpO,研究其定位和酶活性以及參與Mg細(xì)胞毒性中的作用。 研究目的 純化出GlpK蛋白和抗GST-GlpK抗體,檢測GlpK酶活性和GlpK參與Mg細(xì)胞毒性中的作用；純化出GlpO蛋白和抗GST-GlpO抗體,檢測GlpO定位與酶活性和GlpO參與Mg細(xì)胞毒性中的作用。 研究方法 1、Mg GlpK的甘油激酶活性 構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX6p-1/GlpK,誘導(dǎo)表達(dá)GST-GlpK融合蛋白,純化后免疫BALB/c、鼠取抗血清,進(jìn)行鑒定和抗體效價(jià)測定,純化pAb；純化出GlpK蛋白,檢測其酶活性及溫度和pH的影響。 2、Mg Glp0的細(xì)胞定位及3-磷酸甘油氧化酶活性 構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX6p-1/GlpO,誘導(dǎo)表達(dá)GlpO-GST融合蛋白,純化后免疫BALB/c小鼠取抗血清,進(jìn)行鑒定和抗體效價(jià)測定,純化pAb；純化出GlpO蛋白,檢測其酶活性及溫度和pH的影響；分離Mg膜蛋白和胞漿蛋白,分析GlpO蛋白的細(xì)胞定位。 3、GlpK和GlpO對(duì)細(xì)胞毒性的調(diào)控作用 電轉(zhuǎn)化構(gòu)建、篩選和鑒定GlpK和GlpO功能缺陷株；濕重法繪制Mg的碳源生長曲線；Western blotting檢測碳源對(duì)GlpK或GlpO表達(dá)的影響；結(jié)合抗體抑制實(shí)驗(yàn)檢測甘油代謝下Mg產(chǎn)生H2O2的量,觀察HeLa細(xì)胞的毒性變化和HeLa細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。 研究結(jié)果 1、PCR擴(kuò)增出1524bp目的片段,雙酶切和測序證實(shí)成功構(gòu)建出pGEX6p-1/GlpK重組質(zhì)粒,成功表達(dá)了83kDa的可溶性目的蛋白,純化目的蛋白免疫BALB/c小鼠制備獲得pAb,效價(jià)可達(dá)1：16000；GST-GlpK融合蛋白經(jīng)酶切后,純化出57kDa的GlpK靶蛋白,測定其甘油激酶活性為1.73U/mL,且隨溫度和pH值升高而升高。 2、PCR擴(kuò)增出1152bp目的片段,雙酶切及測序證實(shí)成功構(gòu)建出pGEX6p-1/GlpO重組質(zhì)粒,成功表達(dá)出68kDa的可溶性目的蛋白,純化后目的蛋白免疫BALB/c小鼠制備獲得pAb,其效價(jià)為1：32000; GST-GlpO融合蛋白經(jīng)酶切后純化出42kDa的GlpO靶蛋白,測定其3-磷酸甘油氧化酶活性為4.26U/mL,40℃和pH7時(shí)活性最高；G1pO蛋白在Mg胞膜和胞漿中均表達(dá),但大部分位于胞漿中 3、電轉(zhuǎn)化后未篩選出GlpK和GlpO突發(fā)株；在葡萄糖下Mg生長迅速,在未加碳源或甘油下生長緩慢；甘油組和抗GST-GlpK抗體組Mg產(chǎn)生的H2O2明顯高于未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組；甘油組和抗GST-GlpK抗體組的HeLa細(xì)胞存活率明顯低于未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組：甘油組的HeLa細(xì)胞胞內(nèi)檢測出大量的H202和ROS,未加甘油組和抗GST-GlpO抗體組未檢測出。結(jié)論 1、成功構(gòu)建出pGEX6p-1/GlpK和pGEX6p-1/GlpO重組質(zhì)粒,并成功表達(dá)出GST-GlpK和GST-GlpO重組蛋白。 2、GlpK具有甘油激酶活性；GlpO為跨膜蛋白,具有3-磷酸甘油氧化酶活性。 3、甘油代謝下GlpO參與到Mg對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 酈銀芳;于瑩;陸志芳;;IL-13和TNF-α在肺炎支原體肺炎兒童血清中的表達(dá)及意義[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2010年04期

2 辛勝男;張可心;張名岳;韓宗璽;邵昱昊;劉曉麗;劉勝旺;馬得瑩;;鴿β-防御素5基因克隆及其抗菌活性[J];生物工程學(xué)報(bào);2012年11期

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本文編號(hào)：2383785