【摘要】：環(huán)境內分泌干擾物是一類存在于環(huán)境中的化學物質,可通過多種途徑進入機體,直接或間接損害人類健康,因此成為當今環(huán)境衛(wèi)生領域的研究熱點。DEHP作為常見的環(huán)境內分泌干擾物,廣泛應用于食品包裝材料、容器、醫(yī)療用品及兒童玩具等方面,可以導致不孕不育、性早熟、子宮出血等疾病發(fā)生,已引起社會和學者的廣泛關注。目的:本研究從組織形態(tài)學和分子生物學方面,系統(tǒng)地探討DEHP暴露對青春期雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸相關激素分泌水平,以及對相關基因和蛋白表達情況的影響,闡明DEHP暴露對青春期雌性大鼠的生殖內分泌干擾作用及其機制,揭示DEHP的雌性生殖毒性,為明確DEHP對人類生殖系統(tǒng)的潛在危害提供科學依據。方法:選擇健康清潔級雌性Wistar大鼠48只為實驗動物,21日齡,體重50~60g。隨機分為4組,即對照組、低劑量組(250 mg/kg/d DEHP,1/120LD50)、中劑量組(500 mg/kg/d DEHP,1/60LD50)、高劑量組(1000 mg/kg/d DEHP,1/30LD50),每組12只。適應性飼養(yǎng)一周后,于每天清晨灌胃染毒1次,連續(xù)染毒4周。每日稱重,記錄飲食、飲水量,觀察陰道開口情況并記錄陰道開口時間。于動情間期處死大鼠,采血,離心后收集血清;取卵巢和子宮組織并稱重,計算各臟器系數(shù);HE染色法觀察青春期雌性大鼠下丘腦、垂體、卵巢和子宮的病理組織變化;ELISA法檢測大鼠下丘腦Gn RH激素分泌水平;放射免疫分析法檢測大鼠血清中FSH、LH、E2、P和T分泌水平;實時熒光定量PCR法檢測下丘腦-垂體-卵巢軸Gn RH、Kiss-1、GPR54等基因m RNA的表達情況;免疫組織化學染色法觀察下丘腦-垂體-卵巢軸Gn RH、Kiss-1、GPR54等蛋白的定位情況;Western blot法測定下丘腦-垂體-卵巢軸相關蛋白的定量表達情況。結果:1.DEHP對青春期雌性大鼠的一般毒性及生殖毒性(1)DEHP染毒組大鼠活動減少,精神不振,行動遲緩,皮毛疏松無光澤,有脫毛現(xiàn)象,以高劑量組最為明顯。(2)與對照組比較,DEHP染毒組大鼠攝食量和體重顯著增加(P0.05);而飲水量顯著減少(P0.05)。(3)與對照組比較,DEHP染毒組大鼠陰道開口時間顯著提前(P0.05);染毒組大鼠動情間期和動情周期的持續(xù)時間顯著延長(P0.05)。(4)DEHP染毒組部分大鼠卵巢充血、腫脹,體積增大;子宮體積增大,偶見水腫。(5)與對照組比較,DEHP染毒組大鼠卵巢臟器系數(shù)顯著升高(P0.05)。2.青春期雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸組織形態(tài)觀察(1)DEHP染毒組與對照組青春期雌性大鼠下丘腦神經膠質細胞、神經元細胞以及神經纖維結構正常,神經元胞體呈多角形,胞核大而圓,居中,核仁大、圓、深染,胞質中充滿深紫色小塊或顆粒狀尼氏體;神經膠質細胞的胞體和胞核均較大;少突膠質細胞的胞體較小,呈圓或卵圓形。(2)對照組和DEHP染毒組大鼠垂體遠側部均可見嗜酸性細胞、嗜堿性細胞、嫌色細胞和毛細血管。(3)DEHP染毒組大鼠卵巢顆粒細胞結構疏松、數(shù)量減少、輪廓模糊不清晰,細胞核大小不等;部分卵巢顆粒細胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂等現(xiàn)象。(4)DEHP染毒組大鼠子宮內膜出現(xiàn)胞核假復層、上皮增生以及內皮纖維化;腔上皮細胞疏松、不整齊,細胞核大小不一;固有層腺體萎縮、數(shù)目減少。3.青春期雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸激素水平測定(1)DEHP染毒組大鼠下丘腦Gn RH激素水平顯著高于對照組大鼠(P0.05),且隨著染毒劑量增大而增高,存在劑量-反應關系。(2)與對照組比較,DEHP染毒組大鼠血清FSH、LH、T激素水平顯著降低(P0.05),P激素水平顯著升高(P0.05),E2激素水平無顯著差異(P0.05)。4.青春期雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸相關基因m RNA表達情況(1)與對照組比較,DEHP染毒組大鼠下丘腦Gn RH和GPR54 m RNA表達水平無顯著差異(P0.05),Kiss-1 m RNA表達水平顯著降低(P0.05)。(2)低劑量組大鼠垂體Gn RHR m RNA表達水平明顯低于對照組(P0.05),高劑量組大鼠垂體Gn RHR m RNA表達水平顯著高于其他各組(P0.05);與對照組比較,DEHP染毒組大鼠垂體FSH及LH m RNA表達水平均顯著降低(P0.05)。(3)與對照組比較,DEHP染毒組大鼠卵巢FSHR、LHR m RNA表達水平顯著降低(P0.05),而ERαm RNA表達水平則顯著升高(P0.05)。(4)與對照組比較,DEHP染毒組大鼠子宮Gn RHR m RNA及ERαm RNA表達水平均顯著升高(P0.05)。5.青春期雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸相關蛋白表達情況(1)DEHP染毒組大鼠下丘腦組織中Gn RH、Kiss-1、GPR54蛋白表達水平明顯高于對照組(P0.05)。(2)低劑量組大鼠垂體Gn RHR蛋白表達水平與對照組相比顯著升高(P0.05),中劑量組大鼠垂體Gn RHR蛋白表達水平與低劑量組相比顯著下降(P0.05),高劑量組大鼠垂體Gn RHR蛋白表達水平顯著低于對照組(P0.05);各染毒組大鼠垂體FSH、LH蛋白的表達水平明顯低于對照組(P0.05)。(3)與對照組相比,DEHP染毒組大鼠卵巢FSHR、ERα蛋白的表達水平顯著下降(P0.05);各組大鼠卵巢LHR蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)各組大鼠子宮Gn RHR蛋白的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),低、中劑量組蛋白表達水平與對照組相比顯著下降(P0.05),高劑量組與其他各組相比顯著升高(P0.05)。各組大鼠子宮ERα蛋白的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),與對照組和低劑量組相比,中劑量組蛋白表達水平顯著下降(P0.05);高劑量組與其他各組相比顯著升高(P0.05)。結論:1.DEHP暴露可使青春期雌性大鼠攝食量增加,體重增加,陰道開口時間縮短,動情周期延長。2.DEHP暴露可導致青春期雌性大鼠卵巢臟器系數(shù)增加,卵巢充血、腫脹,體積增大,卵巢顆粒細胞出現(xiàn)不同程度的損傷現(xiàn)象;DEHP可導致青春期雌性大鼠子宮體積增大、水腫,子宮內膜出現(xiàn)不同程度的損傷現(xiàn)象。提示卵巢和子宮可能是DEHP毒性作用的靶器官。3.DEHP暴露可使青春期雌性大鼠下丘腦Gn RH激素水平升高,且隨著染毒劑量的增大而增高,存在劑量-反應關系。還可導致FSH、LH、T激素水平降低,P激素水平升高。提示DEHP可能對青春期雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸具有內分泌干擾作用。4.DEHP暴露可以影響青春期雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸Gn RH、Kiss-1、GPR54、Gn RHR、FSH、LH、FSHR、LHR及ERαm RNA和蛋白的表達。提示DEHP可能是通過影響這些基因的表達水平干擾下丘腦-垂體-卵巢軸的內分泌調節(jié)作用,從而影響性腺的發(fā)育和生殖功能。5.DEHP暴露可導致青春期雌性大鼠子宮Gn RHR m RNA和蛋白表達水平增加。提示DEHP可能是通過影響子宮Gn RHR的表達而影響其生殖功能。綜上,DEHP對青春期雌性大鼠具有生殖毒性,可能通過干擾下丘腦-垂體-卵巢軸的內分泌調節(jié)作用,影響性激素的合成和分泌,損傷雌性動物的性腺和生殖內分泌功能,產生雌性生殖毒性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114

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本文編號：2382116