【摘要】：目的初步探討內質網(wǎng)應激是否參與二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)致H9c2心肌細胞凋亡過程,以及氧化應激是否介導該通路的激活。方法細胞培養(yǎng)至80%左右進行傳代或染毒實驗,CCK-8法檢測24h不同濃度梯度下的細胞活力,計算DMF 24h IC50,最大染毒濃度設計依據(jù)IC50保證細胞活力大于70%。蛋白免疫印跡(western blotting,WB)檢測不同濃度(DMF 24h,0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L)、不同時間(DMF150mmol/L,0h、4h、8h、24h)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)干預(24h,0 mmol/L、4mmol/L NAC 1h、150 mmol/L DMF、4mmol/L NAC1h+150 mmol/L DMF)條件下細胞總蛋白中質網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、PIRE1α、Caspase-12、P-e IF2α、CHOP水平變化,其中最大染毒劑量設計依據(jù)DMF 24h半數(shù)抑制濃度IC50,時間和4mmol/L NAC預干預1h設計參考前期實驗。TUNEL法檢測NAC干預條件下細胞凋亡情況,免疫熒光細胞化學法(IFC)同步定位細胞內GRP78。結果CCK-8法檢測結果顯示DMF在0、50、100、125、150、175、200、225、250mmol/L不同劑量下染毒24h,DMF致H9c2心肌細胞凋亡24h IC50為176.378mmol/L。蛋白免疫印跡顯示,DMF染毒24h(0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L),細胞GRP78、P-eif2α、P-IRE1α、Caspase-12、CHOP的蛋白水平組間差異具有統(tǒng)計學意義(GRP78,F=68.517,P0.001;Peif2α,F=38.932,P0.001;P-IRE1α,F=204.660,P0.001;Caspase-12,F=67.445,P0.001;CHOP,F=130.587,P0.001),隨著染毒劑量的增加,五種應激蛋白水平均不同程度升高,除P-eif2α、CHOP蛋白水平在150 mmol/L最高,其余三種蛋白水平均在100 mmol/L時最大,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明細胞存在內質網(wǎng)應激。150 mmol/LDMF作用0、4、8、24h時,H9c2心肌細胞GRP78、P-eif2α、P-IRE1α、Caspase-12、CHOP的蛋白水平組間差異具有統(tǒng)計學意義(GRP78,F=92.902,P0.001;P-eif2α,F=3316.899,P0.001;P-IRE1α,F=161.780,P0.001;Caspase-12,F=57.485,P0.001;CHOP,F=97.513,P0.001)。伴隨染毒時間的延長,五組蛋白水平均有不同程度上升,除Caspase-12蛋白是一直升高外,其他四組蛋白水平均在8h最高,與對照組比變化有統(tǒng)計學差異(P0.05),說明細胞存在內質網(wǎng)應激,與不同劑量組相比,都伴隨有綜合毒效應最大劑量和時間點。NAC干預后,細胞形態(tài)學觀察150 mmol/L染毒24h后較染毒前,細胞回縮變圓、透亮,且部分漂浮在培養(yǎng)液中,染毒干預組較直接染毒組有所改善。TUNEL法檢測NAC干預條件下24h的細胞凋亡,四組細胞凋亡率存在統(tǒng)計學差異(F=65.653,P0.001),與對照組相比,僅DMF組有統(tǒng)計學差異(P0.05),但NAC+DMF組與DMF組比較凋亡率降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明NAC作用后氧化應激改善,細胞凋亡得到緩解。免疫印跡結果顯示,NAC干預各組細胞總蛋白GRP78、P-IRE1α、Caspase-12、P-eif2α、CHOP水平變化組間差異具有統(tǒng)計學意義(GRP78,F=2688.457,P0.001;P-IRE1α,F=847.743,P0.001;Caspase-12,F=178.206,P0.001;P-eif2α,F=1931.161,P0.001;CHOP,F=42.001,P0.001),其中NAC組與對照組相比無統(tǒng)計學意義,說明NAC本身對H9c2心肌細胞無毒性作用,DMF組與NAC+DMF組比較,GRP78、Peif2α、P-IRE1α、CHOP四種蛋白水平均下降,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明內質網(wǎng)應激與氧化應激的改變有關。免疫熒光細胞化學法(IFC)結果顯微鏡下觀察,對照組和NAC組細胞內核為藍色較完整,少數(shù)細胞GRP78為紅色熒光標記,集中分布在核的兩端,DMF組可見部分細胞核出現(xiàn)碎裂,大部分細胞內GRP78呈斑點或云霧狀彌散分布核周,NAC+DMF組細胞核較DMF組完整,可見部分彌散分布在核周的GRP78,且較DMF組已有所改善。結論內質網(wǎng)應激參與二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)致H9c2心肌細胞凋亡過程,氧化應激可能與內質網(wǎng)應激信號通路的激活有關。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2380257