【摘要】：Melamine(1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺),是一種重要的化工原料,常被用來生產(chǎn)三聚氰胺樹脂與甲醛反應(yīng),用于生產(chǎn)塑料、粘合劑和面料等。盡管在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi),三聚氰胺被準(zhǔn)許可參與食品接觸產(chǎn)品(如食品包裝材料和餐具)的生產(chǎn)過程,但它不是食品添加劑,更沒有允許直接添加到食品中。 Melamine的毒理學(xué)研究起始于1984年。然而,當(dāng)時(shí)melamine的潛在毒性并沒有引起公眾的關(guān)注。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嬰兒或動(dòng)物食用含melamine的食品后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的損傷,其中腎臟是其作用的主要靶器官。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明,melamine可能損害海馬錐體神經(jīng)元功能和誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,并在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其氧化損傷作用。顯然,melamine誘發(fā)的腎毒性并不能完全解釋其神經(jīng)毒性效應(yīng)。 另一方面,melamine引發(fā)的毒性報(bào)道逐漸減少。但仍然未知服用melamine后是否會(huì)影響嬰幼兒的中樞發(fā)育,甚至其毒性是否會(huì)影響成年后的認(rèn)知等�？寡趸瘎┠軌驕p少氧化應(yīng)激,并緩解中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響。維生素C和維生素E是兩種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。它們能及時(shí)分解自由基,抵御異常增加的自由基的攻擊,保護(hù)細(xì)胞正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。聯(lián)合使用維生素C和E能緩解阿爾茲海默癥、帕金森癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥以及共濟(jì)運(yùn)動(dòng)失調(diào)等誘發(fā)的氧化損傷、焦慮和認(rèn)知行為缺陷等,提高日常生活質(zhì)量。 基于以上研究背景,本實(shí)驗(yàn)主要探討慢性口服melamine對(duì)空間認(rèn)知和海馬突觸可塑性的影響。同時(shí),檢測(cè)海馬內(nèi)自由基和抗氧化酶活性的變化。最后,通過服用抗氧化維生素C和E對(duì)melamine引起的氧化損傷進(jìn)行恢復(fù)性治療,并探討其可能機(jī)制。 第一部分Melamine對(duì)空間認(rèn)知和海馬突觸可塑性的影響 目的：探討melamine對(duì)Wistar大鼠的空間認(rèn)知能力和海馬突觸可塑性的影響,并進(jìn)一步揭示其可能的生理機(jī)制。 材料與方法：大鼠隨機(jī)分成兩組：正常對(duì)照組(n=16)和Melamine (n=16)組。采用口服方式給予大鼠melamine懸濁液,每日一次。28天后,進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)melamine對(duì)大鼠的空間認(rèn)知能力的影響,包括學(xué)習(xí)、記憶和再獲取能力。記錄大鼠海馬Schaffer側(cè)枝到CA1區(qū)的突觸傳遞可塑性變化,包括LTP和LTD。采用酶標(biāo)法檢測(cè)口服：melamine后大鼠海馬內(nèi)melamine含量變化。 結(jié)果： 1、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：大鼠口服melamine28天后,海馬內(nèi)melamine含量異常增加,說明melamine能夠通過血腦屏障,并在海馬內(nèi)積累。 2、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示：在學(xué)習(xí)和再獲取學(xué)習(xí)階段,melamine損傷大鼠逃避潛伏期明顯增加；在空間探索階段,目標(biāo)象限停留時(shí)間比率和穿越目標(biāo)平臺(tái)次數(shù)也明顯減少。說明慢性口服melamine能損傷大鼠空間認(rèn)知能力,包括學(xué)習(xí),參考記憶和再獲取能力。 3、電生理記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：服用melamine后,LTP實(shí)驗(yàn)記錄的場(chǎng)電位斜率明顯低于正常組；而LTD實(shí)驗(yàn)記錄的場(chǎng)電位斜率明顯高于正常組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明長(zhǎng)期口服melamine會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬突觸可塑性的損傷。 結(jié)論：melamine能夠通過血腦屏障進(jìn)入大腦,并在海馬腦區(qū)積累。Melamine導(dǎo)致海馬長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性損傷,最終導(dǎo)致認(rèn)知能力,特別是認(rèn)知彈性損傷。 第二部分Melamine導(dǎo)致大鼠空間認(rèn)知損傷與誘發(fā)海馬氧化應(yīng)激相關(guān) 目的：為證實(shí)melamine導(dǎo)致空間認(rèn)知損傷是否與破壞海馬內(nèi)氧化與抗氧化穩(wěn)態(tài)相關(guān)。 方法：大鼠分為正常對(duì)照組(n=8)和Melamine (n=8)組。采用口服方式給予大鼠melamine懸濁液,每日一次。28天之后,進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了melamine對(duì)空間認(rèn)知能力的影響以及海馬內(nèi)自由基、MDA、SOD和ATP水平。 結(jié)果： 1、慢性口服]melamine4周中,大鼠體重增加量明顯減少。同時(shí),海馬內(nèi)melamine濃度異常增加。 2、水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示：在學(xué)習(xí)階段,melamine損傷大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),在空間記憶階段,其目標(biāo)象限停留百分比和目標(biāo)平臺(tái)穿越次數(shù)均明顯減少。 3、組織學(xué)HE染色結(jié)果表明：melamine導(dǎo)致海馬神經(jīng)元染色明顯加深,細(xì)胞核固縮,細(xì)胞松散,細(xì)胞質(zhì)減少,出現(xiàn)大量壞死現(xiàn)象。 4、生化檢測(cè)試驗(yàn)表明：慢性口服melamine會(huì)增加海馬內(nèi)自由基、MDA和ATP含量,同時(shí)降低抗氧化酶活性,如SOD和GSH-Px。 結(jié)論：Melamine在海馬的神經(jīng)毒性與氧化應(yīng)激有關(guān)。 第三部分VC與VE聯(lián)合對(duì)melamine導(dǎo)致的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的恢復(fù)作用 目的：探討單獨(dú)使用VC、VE或聯(lián)合使用vitamin對(duì)melamine在PC12細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激的恢復(fù)作用。 方法：利用PC12細(xì)胞建立離體melamine損傷模型。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)自由基數(shù)目。通過Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。生化檢測(cè)抗氧化酶系統(tǒng)在恢復(fù)前后的改變。 結(jié)果： 1、Melamine損傷后,單獨(dú)使用VC、VE或聯(lián)合使用vitamin均能一定程度上恢復(fù)細(xì)胞存活率,但聯(lián)合使用維生素更具有優(yōu)勢(shì)。 2、聯(lián)合維生素能有效地減少自由基的異常積累,降低MDA水平,幫恢復(fù)抗氧化酶活性,如SOD, CAT和GSH-Px。 3、Hoechst33342染色和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示：melamine能明顯誘發(fā)細(xì)胞凋亡,并且聯(lián)合vitamin能有效減少凋亡細(xì)胞數(shù)目。 4、聯(lián)合使用vitamin通過抑制caspase-3活性抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。結(jié)論：聯(lián)合VC和VE能有效降低melamine誘發(fā)的氧化損傷,并抑制細(xì)胞凋亡。 第四部分VC與VE聯(lián)用對(duì)melamine誘發(fā)的認(rèn)知損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究 目的：探討聯(lián)合使用VC和VE對(duì)melamine損傷大鼠認(rèn)知功能的恢復(fù)作用及其機(jī)制,包括氧化損傷和海馬突觸可塑性。 材料與方法：三周雄性大鼠隨機(jī)分成四組：正常對(duì)照組(n=16),melamine(n=16), melamine+vitamin組(n=16)和vitamin組(n=16)。采用口服方式給予melamine懸濁液,每日一次,建立melamine損傷動(dòng)物模型。隨后,給予一周聯(lián)合維生素C和E,腹腔注射每日一次。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了大鼠空間認(rèn)知能力變化。組織學(xué)HE染色觀察海馬錐體神經(jīng)元形態(tài)變化。記錄大鼠海馬Schaffer側(cè)枝到CA1區(qū)的突觸可塑性變化,包括LTP和LTD。采用酶標(biāo)法檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)自由基、MDA、NO和抗氧化劑和凋亡相關(guān)酶活性的變化等。 結(jié)果： 1、聯(lián)合使用VC和VE能恢復(fù)大鼠空間認(rèn)知損傷,包括能有效的改善學(xué)習(xí)和參考記憶能力,并一定程度上緩解再學(xué)習(xí)能力。 2、組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合vitamin能有效減少melamine導(dǎo)致的細(xì)胞壞死等損傷。 3、電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：melamine會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程可塑性的損傷。聯(lián)合使用viatamin能緩解海馬突觸可塑性損傷,包括LTP和LTD。 4、Melamine損傷大鼠注射VC和VE后,海馬中自由基、MDA和NO含量恢復(fù)到正常水平。SOD、CAT、GSH-Px和NOS的活性也明顯提高。神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和caspase-3的活性也明顯提高。 結(jié)論：聯(lián)合VC和VE通過干預(yù)氧化損傷過程,降低melamine誘發(fā)的神經(jīng)毒性,為治愈melamine導(dǎo)致的認(rèn)知損傷提供了新的可能依據(jù)。 第五部分慢性孕期酒精導(dǎo)致大鼠性別二態(tài)性的空間認(rèn)知和突觸可塑性平衡損傷 目的：探討孕期酒精性別二態(tài)性的認(rèn)知行為變化,應(yīng)用突觸可塑性平衡探討空間認(rèn)知損傷的機(jī)制。 材料與方法：母鼠在妊娠期口服酒精并選取其雌雄后代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。出生后36天后代大鼠進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)其空間認(rèn)知功能變化,記錄其海馬Schaffer側(cè)枝到CA1區(qū)的突觸可塑性變化。用方向指數(shù)衡量雌雄大鼠突觸可塑性平衡的差異,進(jìn)一步揭示其性別二態(tài)性。 結(jié)果： 1、CPEE使后代大鼠體重增加明顯減少,同時(shí)導(dǎo)致頭小畸形和海馬重量減輕。 2、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示：CPEE后代大鼠的逃避潛伏期明顯增加,并且其趨壁性明顯增多。在探索階段,CPEE后代大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和目標(biāo)平臺(tái)穿越次數(shù)均明顯減少。此外,雌性后代比雄性后代認(rèn)知損傷更嚴(yán)重。 3、電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CPEE導(dǎo)致雄性后代LTP明顯降低而去增益明顯增強(qiáng)；而雌性LTP明顯增強(qiáng)而去增益明顯減弱。此外,雌性后代的損傷程度更嚴(yán)重。 4、方向指數(shù)進(jìn)一步揭示較雄性大鼠,雌性后代突觸可塑性平衡損傷更為嚴(yán)重。 結(jié)論：CPEE導(dǎo)致認(rèn)知和可塑性平衡性別二態(tài)性,并且突觸可塑性平衡為CPEE引起的中樞功能紊亂提供了新的解釋。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2368869