【摘要】：目的:隨著越來(lái)越多的化學(xué)物進(jìn)入人類(lèi)的生產(chǎn)和生活,如何對(duì)化學(xué)物潛在的毒性進(jìn)行安全性評(píng)價(jià),成為當(dāng)今全球廣泛關(guān)注的問(wèn)題。一般傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),存在實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng),影響因素復(fù)雜等諸多方面問(wèn)題;而體外實(shí)驗(yàn)缺乏各種生理屏障,不具備體內(nèi)代謝作用等缺點(diǎn),影響了結(jié)果外推到人。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立體外細(xì)胞模型替代方法,克服目前體外實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn),對(duì)外源化合物的毒性進(jìn)行更為快速準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。方法:1體外血腦屏障(blood brain barrier,BBB)模型的建立和驗(yàn)證:免疫印跡法測(cè)定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞的緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、Occludin-1和Claudins的表達(dá)。用HUVEC和膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6),通過(guò)非接觸式共培養(yǎng),建立體外BBB模型。用Millicell-ERS儀測(cè)定共培養(yǎng)模型的跨內(nèi)皮阻抗(Trans-endotheilal electrical resistance,TEER)驗(yàn)證BBB的緊密連接性,用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的示蹤效應(yīng)驗(yàn)證BBB的通透性。2多器官細(xì)胞共培養(yǎng)(integrate discrete multiple organ cell co-culture,idMOC)模型的建立和驗(yàn)證:采用自制的多器官細(xì)胞共培養(yǎng)板。在十二孔板中,每四個(gè)孔為一組,在距離孔板底部一定高度處進(jìn)行打孔,各孔間可互相連通。培養(yǎng)時(shí),將HK-2細(xì)胞、L-02細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞接種于自制的多器官細(xì)胞共培養(yǎng)板的不同孔中,并使其互相連通,觀察HK-2細(xì)胞、人L-02肝細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)情況,建立共培養(yǎng)模型。每天取三塊共培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)板和三塊單培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)板,進(jìn)行檢測(cè)直至第四天。CCK-8法分別測(cè)量共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)下的生長(zhǎng)曲線,觀察共培養(yǎng)條件下各組織細(xì)胞與單獨(dú)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線是否一致,確定idMOC模型是否建立成功。3 BBB和idMOC模型的應(yīng)用:以140μg/ml、270μg/ml濃度的丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)對(duì)SH-SY5Y直接染毒;ACR經(jīng)BBB后,取孔板內(nèi)全部培養(yǎng)基對(duì)SH-SY5Y染毒;以及ACR在idMOC條件下對(duì)SH-SY5Y染毒,流式細(xì)胞分析不同處理?xiàng)l件下SH-SY5Y細(xì)胞晚期凋亡率的變化,探索BBB和idMOC體外模型的應(yīng)用。結(jié)果:1體外BBB模型的建立1.1體外BBB模型的建立BBB形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)在于內(nèi)皮細(xì)胞間形成緊密連接(tight junction,Tj),本實(shí)驗(yàn)對(duì)所用細(xì)胞株HUVEC的Tj相關(guān)蛋白Occludin、claudins和ZO-1免疫印跡結(jié)果顯示呈高表達(dá),可以用來(lái)構(gòu)建體外BBB模型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)共培養(yǎng)的方法成功建立了HUVEC單細(xì)胞模型和HUVEC細(xì)胞與C6細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。1.2體外BBB模型的驗(yàn)證HUVEC在C6膠質(zhì)細(xì)胞的作用下,細(xì)胞間可以形成廣泛的緊密連接復(fù)合體進(jìn)而抑制外加電場(chǎng)下電流的跨內(nèi)皮運(yùn)動(dòng),產(chǎn)生了高達(dá)235Ω/cm2的TEER值;并且TEER值均數(shù)在4、5、6 d時(shí)均高于內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組,差異有顯著性意義(P0.05)。一般而言TEER值越大,說(shuō)明BBB的通透性愈小,其屏障功能愈好。HRP與底物反應(yīng)后產(chǎn)生顯色反應(yīng),在450 nm的吸光度(D450)與HRP濃度具有良好的線性關(guān)系,說(shuō)明在60 min的測(cè)試過(guò)程中各模型的性能穩(wěn)定。在20 min后各時(shí)間點(diǎn)HRP的累計(jì)清除量(△TCl)共培養(yǎng)組均小于單獨(dú)培養(yǎng)組,差異有顯著性意義(P0.05),表明共培養(yǎng)組的屏障功能高于單獨(dú)培養(yǎng)組。2體外idMOC模型的建立:2.1 idMOC模型的建立利用自制的多器官細(xì)胞共培養(yǎng)板,建立了穩(wěn)定的idMOC模型。各種細(xì)胞間可通過(guò)培養(yǎng)板的交換孔進(jìn)行物質(zhì)交換,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,無(wú)明顯死亡。通過(guò)該共培養(yǎng)模型,模擬了物質(zhì)在體內(nèi)經(jīng)肝臟和其他代謝器官的代謝過(guò)程。2.2 idMOC模型的驗(yàn)證通過(guò)共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)組細(xì)胞與單獨(dú)陪養(yǎng)組相比生長(zhǎng)曲線基本一致,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 BBB和idMOC模型的應(yīng)用:利用ACR對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞直接染毒、和經(jīng)過(guò)BBB和idMOC模型后染毒,觀察晚期凋亡率。140μg/m L、270μg/m L ACR直接染毒組,晚期凋亡率分別為(23.53±1.80、82.57±2.56);ACR經(jīng)BBB后染毒組,晚期凋亡率分別為(20.27±0.57、73.83±0.76);經(jīng)idMOC模型染毒組,晚期凋亡率從分別為(12.73±1.00、52.73±1.56%)。不同濃度ACR經(jīng)過(guò)BBB和idMOC模型后染毒,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用顯著降低。結(jié)論:1成功建立了基于HUVEC細(xì)胞和C6細(xì)胞共培養(yǎng)體系的體外BBB模型。2成功建立了以HK-2細(xì)胞、人L-02肝細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞共培養(yǎng)為基礎(chǔ)的體外idMOC代謝模型。3不同濃度ACR經(jīng)過(guò)BBB和idMOC模型后染毒,對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用顯著降低,說(shuō)明體外BBB的屏障效應(yīng)和體外idMOC模型的代謝可以減弱ACR毒性的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 梁靜;劉軍;賀全國(guó);;血腦屏障通透性增效方法的研究進(jìn)展[J];化學(xué)通報(bào);2015年03期

2 陳雪;王軍;王偉;駱翔;喻志源;;體外血腦屏障模型的建立及功能測(cè)定[J];卒中與神經(jīng)疾病;2014年04期

3 張水華;季龍鳳;馬t，

本文編號(hào)：2352050