【摘要】：氯酚類化合物作為一類持久性有機污染物,在醫(yī)藥、農(nóng)藥、工業(yè)生產(chǎn)和合成材料等多個行業(yè)廣泛使用,不可避免會對生態(tài)環(huán)境造成難以估量的影響。氯酚類化合物在環(huán)境中分布較廣,大氣、水體及土壤中均有其蹤影,而且它們通常難以降解,不僅危害到生態(tài)環(huán)境中各種動植物的正常生長和繁殖,甚至還可以通過食物鏈或直接接觸,威脅人類健康。2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)是氯酚類化合物中十分重要的一類物質(zhì),主要用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中于2,4-二氯苯氧乙酸、藥物硫雙二氯酚以及除草醚的合成。因其在生產(chǎn)活動中的大量使用,難以避免會被釋放到環(huán)境中,從而會對生物體產(chǎn)生危害作用,2,4-DCP已被我國和美國等眾多國家列入了優(yōu)先控制污染物的名單�；贗llumina/Solexa高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序和分析技術(shù)(RNA-seq)可以在任何物種間實現(xiàn)單核苷酸水平的整體轉(zhuǎn)錄情況檢測,通過檢測結(jié)果可以進行轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的分析及基因表達水平的分析。同時,還可以通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本,全面的提供轉(zhuǎn)錄組信息。相比與傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù),RNA-seq并不需要預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針,也不受有無參考序列的限制。通過使用RNA-seq對轉(zhuǎn)錄組的研究,可以從整體水平上揭示基因結(jié)構(gòu)以及基因功能,發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生過程或特定生物學(xué)過程中的分子機制�，F(xiàn)有對于2,4-DCP的研究,多集中于環(huán)境中2,4-DCP的降解。2,4-DCP毒性機理的研究多處于生理指標(biāo)的測定,而結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的2,4-DCP毒性研究尚未見報道。本研究通過建立2,4-DCP處理人肝細胞HL-7702的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行序列比對、功能注釋及通路分析。通過對比2,4-DCP處理組細胞和對照組(無2,4-DCP處理)細胞的轉(zhuǎn)錄組差異表達,篩選出與2,4-DCP毒性等相關(guān)的基因,從而系統(tǒng)探討其毒性機制。本論文得到的研究結(jié)果如下：1.通過RNA-seq技術(shù),本研究共得到原始數(shù)據(jù)7.77 GB,其中對照組和2,4-DCP處理組分別得到54711542和51353236條的高質(zhì)量配對短序列,其中能夠比對到參考序列上的總reads條數(shù),空白組有45318071條,2,4-DCP處理組有42090330條。覆蓋度為90%-100%的基因分別占總基因數(shù)的56%和55%。2.通過對兩組細胞轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果進行差異基因表達分析,共篩選出1 521個差異表達基因(FDR≤0.001 AND |log2Ratio|≥1),其中上調(diào)基因數(shù)為795個,下調(diào)基因數(shù)為726個。3.經(jīng)過GO功能顯著性富集分析和KEGG通路富集分析,這些差異表達的基因主要參與固醇類的合成、細胞代謝、組織發(fā)育和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等生物過程。4.采用實時定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)對ATP8A1、ATP8B4、CYP1A1、 CYP1B1、CYP2E1、CYP4F12、UGT1A6、UGT1A7、DHCR7和DHCR24等10個受2,4-DCP影響顯著的基因進行了深入研究,結(jié)果表明RT-qPCR法與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。這些基因參與細胞膜結(jié)構(gòu)的維持(ATP8A1和ATP8B4)、介導(dǎo)2,4-DCP在細胞內(nèi)的代謝(CYP1A1、CYP1B1、CYP2E1、CYP4F12、UGT1A6和UGT1A7)并調(diào)控固醇類物質(zhì)的合成(DHCR7和DHCR24),在細胞受2,4-DCP處理后,表達明顯改變,也證明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果反映了細胞內(nèi)基因的真實表達情況。通過以上研究,本文發(fā)現(xiàn)2,4-DCP處理細胞后,其發(fā)揮毒性作用的可能機制有以下三點：(1)通過改變膜的磷脂結(jié)構(gòu)進而影響細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。(2)通過代謝產(chǎn)生更具毒性的代謝中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物,影響細胞內(nèi)的正常生理功能。(3)通過影響固醇類激素的合成發(fā)揮其內(nèi)分泌干擾的作用。總之,本文通過轉(zhuǎn)錄組測序從差異基因表達、GO功能富集分析和Pathway分析等方面,結(jié)合RT-qPCR驗證實驗全面系統(tǒng)地闡明了在2,4-DCP的作用下人肝細胞HL-7702的轉(zhuǎn)錄本特點,為進一步深入研究2,4-DCP的分子毒性機制奠定了研究基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114;Q78

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本文編號：2350462